As conexinas (Cx) são proteínas de membrana caracterizadas por quatro domínios transmembrânicos, duas alças extracelulares, uma alça intracelular e segmentos N- e C-terminais citoplasmáticos. Estes últimos são variáveis entre membros dessa família de proteínas. Seis cadeias de Cx oligomerizam-se para formar um conexon ou hemicanal. Dois conexons em membranas de células adjacentes associam-se formando um canal intercelular, conhecido como junção comunicante ou do tipo fenda (gap junction), o qual é responsável pelo transporte de pequenas moléculas e íons entre as células. A conexina 26 (Cx26), proteína codificada pelo gene GJB2, é expressa em diferentes tecidos, incluindo a cóclea. Mutações no gene GJB2 são responsáveis por 50% dos casos de perdas auditivas não sindrômicas com herança autossômica recessiva e quase 10% dos casos de surdez congênita. Papel funcional fundamental foi proposto para a Cx26 na manutenção e na reciclagem de potássio (K+) na endolinfa, fluido presente na cóclea, na orelha interna. Por meio da identificação de proteínas que interagem com a Cx26 e da caracterização de sua rede de interações buscamos descobrir quais genes correspondentes poderiam ser candidatos para explicar a perda auditiva em humanos. Também buscamos verificar se há suporte para a hipótese de que a Cx26 poderia estar localizada na mitocôndria. Para atingir esses objetivos, analisamos os resultados de um Ensaio de Duplo Híbrido de Membrana de Levedura (EDHML) realizado com uma biblioteca de cDNA de encéfalo fetal humano, por meio da análise in silico de cada proteína identificada pela interação com a Cx26. Utilizamos os seguintes bancos de dados: WebGestalt para estudar a ontologia gênica; ProtScale para determinar a hidrofobicidade dos SID (selected interaction domain); SHIELD (Shared Harvard Inner-Ear Laboratory Database) e NCBI (National Center for Biotechnology Information) para verificar a expressão dos genes na cóclea ou orelha interna. Os bancos de dados UCSC (University of California Santa Cruz Genome Institute), Hereditary Hearing Loss Homepage e OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man) foram utilizados para verificar a localização cromossômica dos genes e dos lócus de surdez. OMIM também foi utilizado para verificar se os genes possuíam associação conhecida com doença genética, em especial a perda auditiva. NCBI, Uniprot and The Human Protein Atlas foram usados para verificar a localização das proteínas na mitocôndria. STRING (Funcional Protein Association Networks) e BioGRID (Biological General Repository for Interaction Datasets) foram usados para analisar a rede de interação das proteínas identificadas no ensaio e a rede de interação proteína-proteína da Cx26. Um total de 45 proteínas que interagem com a Cx26 foram identificadas pelo ensaio. Dentre essas, 42 genes correspondentes têm expressão na cóclea ou na orelha interna. Além disso, três proteínas têm seus genes localizados dentro ou próximo a lócus de surdez não sindrômica, previamente mapeados por estudos de ligação, mas com genes correspondentes não identificados, sugerindo que são bons candidatos para explicar a perda auditiva. Finalmente, nove proteínas estão localizadas na mitocôndria e duas delas (produtos gênicos de TSPO e FUNDC2) estão localizadas exclusivamente na mitocôndria, sugerindo uma possível localização da Cx26 nas mitocôndrias. Após a análise in silico e classificação hierárquica, 25 proteínas foram consideradas as mais relevantes para audição e são os produtos gênicos de MMD, ELOVL4, GPM6B, DAD1, SLC6A3, RNF41, ACKR1, TSPO, CEND1, FUNDC2, TSPAN7, MSMO1, GPM6A, TTYH1, ATP2A2, SLC33A1, SLC38A3, EBP, IER3IP1, SLC31A2, TMEM87A, TVP23C, MT-ATP6, ERGIC3 e KCNK1. Nossos achados contribuíram para evidenciar o potencial papel das proteínas que interagem com a Conexina 26 na fisiologia da audição.

Connexins (Cx) are membrane proteins characterized by four transmembrane domains, two extracellular loops, one intracellular loop and N- and C-terminal cytoplasmic segments. The terminal segments vary among members of this protein family. Six Cx molecules oligomerize to form a connexon. Two connexons in adjacent cell membranes form an intracellular channel, known as a gap junction, which is responsible for the transportation of small molecules and ions between cells. Connexin 26 (Cx26), a protein encoded by the gene GJB2, is expressed in different tissues, including cochlea. Mutations in GJB2 are responsible for 50% of the cases of autosomal recessive nonsyndromic hearing loss and nearly 10% of all cases of congenital deafness. A functional role has been assigned for Cx26 in the maintenance and recycling of potassium (K+) in the endolymph, a fluid present in the cochlea, in the inner ear. Through the identification of proteins that interact with Cx26 and characterization of its network of interactions, we aimed to find which corresponding genes would be good candidates to explain hearing loss. We also aimed to verify if there is support for the hypothesis that Cx26 could be located in mitochondria. To achieve this, we analyzed the results of a membrane yeast two-hybrid assay performed with a human fetal brain cDNA library through in silico analysis of each protein identified by interaction with Cx26. We used the databases: WebGestalt to study gene ontology; ProtScale to determine the hydrophobicity of the selected interaction domains, SHIELD (Shared Harvard Inner-Ear Laboratory Database) and NCBI (National Center for Biotechnology Information) to verify the expression of genes in the cochlea; The databases UCSC (University of California Santa Cruz Genome Institute), Hereditary Hearing Loss Homepage and OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man) were used to verify the chromosomal location of genes and hearing loss loci and OMIM as well to verify if the genes had a known association with a genetic disease, in particular to hearing loss; NCBI, Uniprot and The Human Protein Atlas were used to verify the localization of proteins in mitochondria; STRING (Functional Protein Association Networks) and BioGRID (Biological General Repository for Interaction Datasets) were used to analyze the protein interaction network of proteins identified in assay and Cx26 protein-protein interaction. A total of 45 proteins that interact with Cx26 were identified by the assay. Among these, 42 corresponding genes were found to be expressed in the cochlea or inner ear. In addition, three proteins have their corresponding genes located within or close to non-syndromic hearing loss-related loci, previously mapped by linkage studies, but with the corresponding genes not yet identified, suggesting they are good candidate genes to explain hearing loss. Finally, nine proteins are located in mitochondria, and two of them (the gene products of FUNDC2 and TSPO) have been exclusively located in mitochondria, suggesting possible Cx26 localization in mitochondria. After in silico analysis and hierarchical classification, 25 proteins were found to be the more relevant to hearing and they were the products of the genes MMD, ELOVL4, GPM6B, DAD1, SLC6A3, RNF41, ACKR1, TSPO, CEND1, FUNDC2, TSPAN7, MSMO1, GPM6A, TTYH1, ATP2A2, SLC33A1, SLC38A3, EBP, IER3IP1, SLC31A2, TMEM87A, TVP23C, MT-ATP6, ERGIC3, and KCNK1. Our findings contributed to highlight the potential role of proteins that interact with Connexin 26 in the physiology of hearing.