Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/T.41.2017.tde-13032017-160422
Documento
Autor
Nome completo
Fernando Gomes
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2016
Orientador
Banca examinadora
Soares Netto, Luis Eduardo (Presidente)
Cunha, Fernanda Marques da
Barros, Mário Henrique de
Demasi, Marilene
Souza, Gisele Monteiro de
Título em português
Caracterização funcional da peroxirredoxina mitocondrial (Prx1) na fisiologia redox de Saccharomyces cerevisiae
Palavras-chave em português
Mitocôndria
Prx1
Saccharomyces cerevisiae
Resumo em português
As peroxirredoxinas (Prxs) são peroxidases dependentes de tiol que catalisam a redução de uma ampla variedade de hidroperóxidos. A atividade catalítica das Prxs é suportada por um resíduo de cisteína catalítico altamente conservado, cuja oxidação pelo hidroperóxido gera o ácido sulfênico (Cys-SOH). Prx1 de Saccharomyces cerevsiae é uma enzima mitocondrial que catalisa a redução do H2O2 gerado no interior da mitocôndria. O mecanismo de redução do ácido sulfênico de Prx1 é uma questão de debate, com a glutarredoxina 2 (Grx2), tiorredoxina 3 (Trx3), tiorredoxina redutase 2 (Trr2) e ascorbato sendo propostos como possíveis redutores. Para avaliar a importância fisiológica de Prx1 na manutenção da homeostase redox mitocondrial, nós investigamos os mecanismos de importação e processamento mitocondrial de Prx1 assim como os de seus possíveis redutores Trr2 e Trx3. Os ensaios de solubilidade e subfracionamento mitocondrial demonstram que Prx1, Trr2 e Trx3 co-localizam na matriz mitocondrial, associadas fracamente com a membrana mitocondrial interna. Além disso, Prx1 apresenta dupla localização, estando presente também no espaço intermembrana mitocondrial possivelmenete na forma solúvel. O mecanismo de importação de Prx1 para o espaço intermembrana envolve a liberação da proteína precursora no interior da bicamada lipídica da membrana interna em decorrência de uma pequena região hidrofóbica localizada imediatamente após a pressequência. Em seguida, a subunidade Imp2 do complexo proteico IMP catalisa a clivagem da região hidrofóbica liberando Prx1 no espaço intermembrana. Durante a importação de Prx1 para a matriz mitocondrial, a enzima é clivada sequencialmente pelas proteases peptidase de processamento mitocondrial (MPP) e octapeptidil aminopeptidase 1 (Oct1). Oct1 catalisa a remoção de oito resíduos de aminoácidos da região N-terminal de Prx1. Esse processamento aumenta a estabilidade de Prx1 no interior da mitocôndria, mas não interfere na sua atividade peroxidásica in vitro. Apesar das enzimas Trr2 e Trx3 não serem clivadas por Oct1, a ausência de Oct1 causa eleavada instabilidade dessas proteínas. O processamento das Prxs por Oct1 parece ser um processo conservado visto que Oct1 de levedura é capaz de clivar a peroxirredoxina mitocondrial humana Prx3 expressa em S. cerevisiae. Estes resultados indicam o envolvimento de Oct1 no processamento das peroxirredoxinas, representando um sistema de controle de qualidade proteico que regula a homeostase das Prxs e, possivelmente, processos redox mitocondriais
Título em inglês
Functional characterization of mitochondrial peroxiredoxin (Prx1) in the redox physiology of Saccharomyces cerevisiae
Palavras-chave em inglês
Mitochondria
Prx1
Saccharomyces cerevisiae
Resumo em inglês
Peroxiredoxins (Prxs) are thiol-dependent peroxidases that catalyze the reduction of a wide variety of hydroperoxides. The Prxs catalytic activity is provided by the presence of a highly conserved catalytic cysteine residue whose oxidation by hydroperoxide generates sulfenic acid (Cys-SOH). Saccharomyces cerevsiae Prx1 is a mitochondrial enzyme that catalyzes the reduction of the H2O2 generated endogenously by mitochondria. The mechanism of reduction of Prx harboring Cys-SOH is a matter of debate, with glutaredoxin 2 (GRX2), thioredoxin 3 (Trx3), thioredoxin reductase 2 (Trr2), and ascorbate being proposed as possible reducers. To assess the functional role of Prx1 in maintaining the mitochondrial redox homeostasis, we investigated its mechanisms of import and processing, as well as those ones involved with its possible reducers, Trr2 and Trx3. Assays of solubility and mitochondrial sub-fractionation show that Prx1, Trr2 and Trx3 co-localize in the mitochondrial matrix compartment, being marginally associated with the inner mitochondrial membrane. In addition, Prx1 show dual localization, being also present in the mitochondrial intermembrane space, possibly in their soluble form. The import mechanism of Prx1 to the intermembrane space involves the release of protein's precursor within the lipid bilayer of the inner membrane due to a small, hydrophobic region located downstream the presequence. Imp2 subunit of the IMP protein complex then catalyzes the cleavage of the hydrophobic region of Prx1, releasing it to the mitochondrial intermembrane space. During its import into the matrix, Prx1 is sequentially cleaved by the mitochondrial processing-peptidase protease (MPP) and by octapeptidil aminopeptidase 1 (Oct1). Oct1 catalyzes the cleavage of eight amino acid residues from the N-terminal region of Prx1. This process increases stability of Prx1 inside the mitochondria, but does not interfere in its peroxidase activity in vitro. Interestingly, absence of Oct1 causes high instability of Trr2 and Trx3, although these proteins are not cleaved by this protease. Remarkably, the processing of Prxs by Oct1 seems to be a conserved process since yeast Oct1 is able to cleave the human mitochondrial peroxiredoxin Prx3 expressed in S. cerevisiae. Altogether, these results indicate the involvement of Oct1 in the processing of peroxiredoxins, representing a protein quality control system that regulates the homeostasis of Prxs and, possibly, mitochondrial redox processes
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Data de Publicação
2017-04-10