A formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) pode ocorrer durante o metabolismo celular, por exemplo pela via da fosforilação oxidativa nas mitocôndrias ou pela via de β-oxidação de ácidos graxos que, pode ocorrer nos peroxissomos ou mitocôndrias, e causa a liberação de peróxido de hidrogênio. Em Saccharomyces cerevisiae, a β-oxidação ocorre estritamente nos peroxissomos. Assim, buscando lidar com esses oxidantes, as células aeróbicas possuem um complexo sistema de defesa antioxidantes, ainda não completamente elucidado. Essas leveduras tem metabolismo preferencialmente fermentativo e quando cultivadas em glicose sofrem repressão catabólica. Portanto, em meios de cultura respiratórios, como em Etanol, por exemplo, não ocorre a repressão catabólica de enzimas responsáveis pela biogênese mitocondrial. S. cerevisiae possui cinco enzimas antioxidantes: Tsa1, Tsa2, Prx1, Dot5 e Ahp1. Esta última, com capacidade de reduzir mais eficientemente alquil-hidroperóxidos. Outras seis enzimas podem reduzir peróxidos na levedura, como as catalases (Cta1 e Ctt1), a Citocromo C peroxidase (Ccp1) e as glutationas peroxidases (Gpx1, Gpx2 e Gpx3). Essas enzimas podem ter sua expressão induzida diferencialmente de acordo com o meio de cultivo. No caso de Gpx1, a expressão é induzida em meio contendo oleato, e este também induz a proliferação peroxissomal. Nessas condições, Gpx1 está localizada no peroxissomos, bem como a Cta1. Ahp1 apresenta o motivo AHL na sua extremidade c terminal que se assemelha à sequência PTS1 envolvida no endereçamento de proteínas ao peroxissomos. Neste trabalho, foi realizada a análise e caracterização de fenótipos de leveduras mutantes para proteínas supostamente envolvidas na defesa de oxidantes gerados pelo peroxissomos, com ênfase no mutante δahp1. Nossos resultados indicaram que Ahp1 tem papel relevante na resposta a insultos oxidativos promovidos por peróxidos orgânicos ou inorgânicos adicionados exogenamente, em diferentes condições metabólicas. Além disso, mostramos que Ahp1 apresenta localização citosólica nas condições metabólicas analisadas. Mostramos ainda que na ausência de Tsa1, Ahp1 atua como um possível mecanismo compensatório, tendo um aumento expressivo nos seus níveis proteicos. Ainda nessa perspectiva, mostramos que, linhagens que tem um aumento em níveis proteicos de Ahp1, como a linhagem δtsa1, tem maior resistência a peróxidos derivados de ácidos graxos adicionados exogenamente. Finalmente, em analises bioquímicas e cinéticas, revisitamos o ciclo catalítico de Ahp1, confirmando o papel de Cys31 como cisteína de resolução e Cys62 como cisteína peroxidásica. Nessas analises, observamos que a presença da cauda Histag na região N-terminal de Tiorredoxina 1 (Trx1) interfere na sua afinidade com Ahp1. Em paralelo, análises das estruturas disponíveis em bancos de dados, indicaram que Ahp1 passa por alterações conformacionais ao longo de seu ciclo catalítico que se assemelham aos estados FF (fully fold) e LU (locally unfolded) bem descritos para 2-Cys Prxs típicas (subfamília Prx1/AhpC) e que estão envolvidos na formação e redução de pontes dissulfeto intermolecular.

The formation of reactive oxygen species (ROS) occurs in cellular metabolism, for example during oxidative phosphorylation in the mitochondria, or in some cases, during the β-oxidation of fatty acids, which can occur in the peroxisomes or mitochondria, and causes the release of hydrogen peroxide. In Saccharomyces cerevisiae, β-oxidation occurs strictly in the peroxisomes. Thus, aerobic cell displays a complex antioxidant defense system to deal with these oxidants, which were not completely elucidated. This yeast preferably utilizes glucose as a carbon source through a fermentative metabolism, leading to a process known as catabolic repression. Therefore, in a respiratory culture media, such as those containing ethanol as carbon source, the catabolic repression of enzymes responsible for mitochondrial biogenesis does not occur. S. cerevisiae has five antioxidant enzymes: Tsa1, Tsa2, Prx1, Dot5, and Ahp1. The latter, with the ability to more efficiently reduce alkyl hydroperoxides. Other six enzymes can reduce peroxides in yeast, such as catalases (Cta1 and Ctt1), Cytochrome C peroxidase, and Glutathione Peroxidases (Gpx1, Gpx2, and Gpx3). These enzymes may have their expression induced according to the culture medium. In the case of Gpx1, expression is induced in medium containing Oleate, and this medium also induces peroxisomal proliferation. Under these conditions, Gpx1 is located in the peroxisomes, as well as catalase A (Cta1). Ahp1 has the AHL motif at its C-terminal end that resembles the PTS1 sequence involved in targeting proteins to peroxisomes. In this work, the analysis and characterization of phenotypes of mutant strains for proteins supposedly involved in the defense of oxidants generated by peroxisomes, with emphasis on the δahp1 mutant, was carried out. Our results indicated that Ahp1 plays a relevant role in response to oxidative insults promoted by exogenously added organic or inorganic peroxides, under different metabolic conditions. Furthermore, we showed that Ahp1 presents cytosolic localization under all the metabolic conditions analyzed. We also showed that in the absence of Tsa1, Ahp1 acts as a possible compensatory mechanism, with a significant increase in its protein levels. In addition, we showed that strains that had an increased Ahp1 protein levels, such as the δtsa1 strain, had greater resistance to exogenous added peroxides derived from fatty acids. Finally, we revisited the catalytic cycle of Ahp1, performing in biochemical and kinetic analyses, though which we confirmed the roles of Cys31 as a resolution cysteine and Cys62 as a peroxidase cysteine. In these analyses, we observed that the presence of a His-tag at the N-terminal end of thioredoxin 1 (Trx1) interferes with its affinity with Ahp1. We also performed analyzes of the structures available in databases, which indicated that Ahp1 undergoes conformational changes throughout its catalytic cycle that resemble the FF (fully fold) and LU (locally unfolded) states, very similar to typical 2-Cys Prxs (Prx1/AhpC subfamily) and which are involved in the formation and reduction of intermolecular disulfide bonds.