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Thèse de Doctorat
DOI
https://doi.org/10.11606/T.3.2019.tde-31052021-094248
Document
Auteur
Nom complet
Gabriela Pannunzio Carmignotto
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
São Paulo, 2019
Directeur
Jury
Azzoni, Adriano Rodrigues (Président)
Santiago, André da Silva
Basso, Thiago Olitta
Magalhães, Geraldo Santana
Soares, Carlos Roberto Jorge
Titre en portugais
Estudo das condições de cultivo de Escherichia coli para a produção da nuclease Cas9, utilizada em sistemas de edição de genoma CRISPR-Cas9.
Mots-clés en portugais
Bioprocessos
Biotecnologia
Escherichia coli
Proteínas recombinantes
Reatores bioquímicos
Resumé en portugais
A técnica CRISPR-Cas9 é uma ferramenta que vem sendo amplamente estudada na edição de genomas. Consiste em um complexo formado por uma nuclease chamada Cas9, que tem a função de cortar o DNA, e em um RNA guia (gRNA), que contém a sequência de reconhecimento do local de corte para a edição. A técnica CRISPR-Cas9 vem ganhando destaque para sua aplicação como ferramenta de biologia molecular e no tratamento de doenças, o que potencializa o uso da proteína Cas9 como biofármaco. Embora amplamente empregada, poucos são os estudos encontrados sobre a produção da proteína recombinante Cas9, de 158 kDa, derivada de Streptococcus pyogenes. Neste contexto, este trabalho tevecomo objetivo realizar um estudo sistemático da produção da proteína Cas9 contendo uma cauda de histidina em meio de cultura complexo e meio definido, empregando o vetor pET28b-Cas9His e duas cepas de E. coli: BL21(DE3) e BL21(DE3) Rosetta. Os resultados mostraram que a expressão da proteína Cas9 foi maior em E. coli BL21(DE3), enquanto que apenas traços da proteína Cas9 foram detectados na Rosetta, resultado do baixo nível de mRNA. O crescimento celular daE. coli BL21(DE3) e a expressão da proteína foram avaliados em meio complexo (LB) e meio definido (HDF) em frascos. A melhor condição de indução para a expressão da proteína Cas9 ocorreu em meio definido HDF, com adição de IPTG e temperatura de indução de 30ºC, em um intervalo de tempo de 8h, obtendo-se a concentração final de 96,4 mg de Cas9/L de cultivo. Ao empregar biorreator operado em modo batelada com meio definido HDF, a concentração celular, a velocidade específica máxima de crescimento e o fator de conversão de substrato em biomassa obtidos foram 5,6 g/L, 0,53 h-1 e 0,55, respectivamente. A concentração de proteína obtida em biorreator foi de 420,1 mg de Cas9/L de cultivo com 6h de indução. Este trabalho possibilitou produzir a proteína Cas9 de forma eficiente ao empregar-se a linhagem E. coli BL21(DE3) em biorreator usando meio definido HDF, com potencial para melhorias adicionais que poderiam facilitar a produção em larga-escala.
Titre en anglais
Study of the culture conditions of Escherichia coli for the production of Cas9 nuclease, used in CRISPR-Cas9 genome-editing systems.
Mots-clés en anglais
Batch mode
Cas9 protein
CRISPR-Cas9
Defined medium
Resumé en anglais
The CRISPR-Cas9 system is a tool that has been extensively studied in genome editing. It consists of a complex composed of a protein called Cas9, which has the function of cleaving the DNA at a specific site, and a guiding RNA (gRNA), which contains the cleavage target for editing. The CRISPR-Cas9 system has been gaining importance for its application as a molecular biology tool and in the treatment of diseases, which potentiates the use of the Cas9 protein as a biopharmaceutical. Although widely employed, few studies have been found on the production of the recombinant Cas9 protein (158 kDa) derived from Streptococcus pyogenes. In this context, this work aims to study the production of the Cas9 protein with a His-tag in complex and defined media using the pET28b-Cas9His vector and two strains of E. coli: BL21 (DE3) and BL21 (DE3) Rosetta. The results showed that Cas9 protein expression was higher in E. coli BL21 (DE3), whereas traces of the Cas9 protein were detected in Rosetta, as a result of the low level of mRNA. Cell growth of E. coli BL21 (DE3) and protein expression were evaluated in complex medium (LB) and defined medium (HDF) in shake-flasks. The best induction condition for Cas9 protein expression in shake-flasks occurred in HDF medium with addition of IPTG and induction temperature of 30°C in a time interval of 8h, reaching concentration of 96.4 mg Cas9/L culture. The cell concentration, the maximum specific growth rate and the substract to cell yield factor obtained in bioreactor in batch mode was 5,6 g/L, 0,53 h1 e 0,55, respectively. The protein concentration obtained was 420.1 mg/L with 6 hours of induction time. This work showed the possibility of produce Cas9 protein efficiently using E. coli BL21(DE3) using defined HDF medium, with potential for further improvements that could facilitate large-scale production.
 
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Date de Publication
2021-05-31
 
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