Geraniol é um monoterpeno, classe de metabólitos secundários de plantas, usado como fragrância em diversos produtos de higiene e cosméticos. Além disso, essa molécula apresenta potencial como fármaco antimicrobiano e antitumoral, por exemplo, e é precursor químico de outros compostos relevantes para a indústria e saúde humana. Apesar de seu mercado crescente, a obtenção de geraniol se restringe à extração de óleos essenciais vegetais ou à síntese química, processos com etapas pouco eficientes, caras ou poluentes. Nesse contexto, o uso da engenharia metabólica para a produção de terpenos por microrganismos é uma alternativa promissora que tem sido explorada no meio científico. Yarrowia lipolytica, uma levedura oleaginosa não convencional, apresenta atributos que podem ser explorados para a produção sustentável e eficiente de geraniol. Essas características incluem tolerância a compostos orgânicos e altos níveis de acetil-CoA citosólico, molécula que inicia a via de biossíntese do monoterpeno. Assim, o presente projeto teve como objetivo o desenvolvimento de linhagem de Y. lipolytica capaz de realizar a biossíntese de geraniol. Para isso, a linhagem de Y. lipolytica que seria transformada foi analisada quanto ao seu crescimento e morfologia celular e sua fisiologia de crescimento foi estudada. Então, os plasmídeos necessários para expressão da geraniol sintase (GES) e sua integração no genoma de Y. lipolytica foram replicados e confirmados. Finalmente, foi aplicado o método de CRISPR-Cas9 para a expressão da enzima GES de Catharanthus roseus na linhagem de Y. lipolytica com modificações para a produção de monoterpenos. Integração do cassete foi confirmada por PCR com DNA genômico como molde. Produção de 35 ± 10 mg L-1 de geraniol (que representa um rendimento de 0.08 % C-mol C-mol-1) pela linhagem BYa3105 geneticamente modificada foi verificada por GC-MS. Portanto, as bases para produção de geraniol foram estabelecidas e poderão ser adicionalmente exploradas nas próximas etapas do projeto. Esse é o primeiro relato conhecido da biossíntese de novo de geraniol por Y. lipolytica.

Geraniol is a monoterpene, a class of secondary metabolites of plants, used as a fragrance in various hygiene and cosmetic products. In addition, this molecule also has potential, for example, as an antimicrobial and antitumor drug and as a chemical precursor of other compounds relevant to industry and human health. Despite its growing market, obtainment of geraniol is restricted to the extraction of plant essential oils or chemical synthesis, which are processes with inefficient, expensive or polluting steps. In this context, the use of metabolic engineering for the production of terpenes by microorganisms is a promising alternative that has been explored by the scientific community. Yarrowia lipolytica, a non-conventional oleaginous yeast, has attributes that can be exploited for the sustainable and efficient production of geraniol. These characteristics include tolerance to organic compounds and high levels of cytosolic acetyl-CoA, the molecule that initiates the monoterpene biosynthesis pathway. Thus, the present project aimed to develop a Y. lipolytica strain engineered for the biosynthesis of geraniol. For this, the Y. lipolytica strain to be transformed was analyzed for its growth and cellular morphology and its growth physiology was studied. Then, the plasmids required for geraniol synthase (GES) expression and its integration into the Y. lipolytica genome were replicated and confirmed. Finally, the CRISPRCas9 genome editing system was applied for the expression of the GES enzyme from Catharanthus roseus in the Y. lipolytica strain with modifications for the production of monoterpenes. Integration of expression cassette at the target locus was confirmed with diganosis PCR with genomic DNA as template. Production of 35 ± 10 mg L-1 geraniol (which represents a yield of 0.08 % C-mol geraniol C-mol-1 glucose) by the genetically modified BYa3105 strain was verified via GC-MS. Therefore, the basis for a bioprocess of geraniol production have been established and may be further explored in the next stages of the project. This is the first known report of de novo geraniol biosynthesis by Y. lipolytica.