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Dissertação de Mestrado
DOI
10.11606/D.3.2013.tde-24122013-112802
Documento
Autor
Nome completo
Bruno Labate Vale da Costa
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2013
Orientador
Banca examinadora
Tonso, Aldo (Presidente)
Augusto, Elisabeth de Fátima Pires
Gombert, Andreas Karoly
Título em português
Cultivos de células animais visando a altas concentrações celulares: processo em perfusão e suplementação com aminoácidos.
Palavras-chave em português
BHK-21
Células animais
Drosophila melanogaster S2
Metabolismo celular
Perfusão
Spin-filter
Resumo em português
Células animais são alvo de pesquisas visando sua utilização como plataforma para a expressão de proteínas recombinantes, desde vacinas veterinárias até fatores de coagulação para hemofílicos. Exemplos incluem células de inseto Drosophila melanogaster S2 e células de mamífero BHK-21, que vêm sendo estudadas visando a sua utilização para a produção da glicoproteína do vírus da raiva. Independentemente da estratégia de cultivo utilizada, altas concentrações celulares são em geral associadas a uma maior produção da proteína de interesse. O objetivo deste trabalho foi o de investigar estratégias que possibilitariam o cultivo de células animais em altas concentrações celulares. Células de inseto Drosophila melanogaster S2 produtoras da glicoproteína do vírus da raiva foram cultivadas em frascos agitados a 100 rpm e 28, em meio livre de soro SF 900 II suplementado com os aminoácidos asparagina, cisteína, prolina e serina. A adição dos quatro aminoácidos no meio de cultura refletiu em um aumento da concentração celular máxima (XV MÁX) em 16%. Cisteína, quando adicionada isoladamente no meio de cultura, refletiu em uma velocidade específica máxima de crescimento celular (MÁX) 56% maior. Nessa condição, o fator de conversão glicose a célula (YX/GLC) foi 47% maior, indicando um metabolismo de glicose mais eficiente na geração de células. Esses resultados indicam que cisteína é provavelmente substrato limitante do cultivo de células S2AcGPV em meio SF 900 II. Já células de mamífero BHK-21 (C13), adaptadas ao crescimento em suspensão, foram cultivadas em processo de perfusão, processo contínuo em que há retenção celular, o que permite alcançar concentrações celulares mais altas que processos em batelada ou em modo contínuo sem retenção celular. Foi utilizado um biorreator do tipo tanque agitado com 1,5 L de volume de trabalho e spin-filter interno, com poro de diâmetro igual a 10 m, acoplado ao eixo do impelidor. Durante o cultivo, o pH foi controlado em 7,2, a agitação em 80 rpm, a temperatura em 37 e o oxigênio dissolvido em 50% da saturação com o ar. A concentração celular máxima alcançou 15,7 x 106 céls mL-1, muito superior à do cultivo em batelada (aproximadamente 5 x 106 céls mL-1). A viabilidade celular foi superior a 90% durante os 48 dias de cultivo. Na fase batelada do cultivo em perfusão, as velocidades de consumo de glicose (qGLC) e de glutamina (qGLN) foram 84% e 32% maiores, respectivamente, em relação às velocidades observadas no cultivo em batelada. Analogamente, as velocidades de produção de lactato (qLAC) e de amônio (qNH4) foram 78% e 102% maiores, respectivamente. Ainda, o coeficiente de manutenção celular não foi desprezível, e o consumo de glicose associado à manutenção celular foi de 83%. Esses dados indicam que a presença do spin-filter interno pode estar associada a estresse celular. Na perfusão, a concentração celular foi cerca de 3 vezes maior do que no cultivo contínuo sem reciclo de células. Provou-se que é possível cultivar células BHK-21 adaptadas a crescimento em suspensão em altas concentrações celulares em escala laboratorial, utilizando biorreator de bancada e spin-filter interno como sistema de retenção celular.
Título em inglês
Animal cell cultures aiming high cell concentrations: perfusion process and amino acids supplementation.
Palavras-chave em inglês
Animal cells
BHK-21
Cell metabolism
Drosophila melanogaster S2
Perfusion
Spinfilter
Resumo em inglês
Animal cells have been under research as a platform for the expression of recombinant proteins, ranging from veterinary vaccines to blood coagulation factors for treating hemophilia. Examples include insect Drosophila melanogaster S2 and hamster BHK-21 cells, currently being studied for the production of rabies virus glycoprotein. Regardless of the cultivation strategy, high cell concentrations are usually associated to a higher protein production. Thus, the aim of this research was to investigate animal cell cultivation strategies that would allow higher cell concentrations than those previously reported. Cells of Drosophila melanogaster S2 expressing the rabies virus glycoprotein (S2AcGPV) were cultivated in shake flasks at 100 rpm and 28 , in SF 900 II serum-free medium supplemented with the following amino acids: asparagine, cysteine, proline, and serine. The addition of the four amino acids to the medium increased the maximum cell concentration (XV MAX) in 16%. When only cysteine was added to the medium, the maximum specific growth rate (ÊMAX) was 56% higher. In this condition, the cell yield on glucose (YX/GLC) was 47% higher, indicating a more efficient glucose metabolism. These results show that cysteine is likely a limiting substrate of S2AcGPV cells growing in SF 900 II medium. In turn, baby hamster kidney cells (BHK-21/C13), adapted to growth in suspension culture, were cultivated in perfusion, a continuous process with cell retention that allows higher cell concentration than batch or continuous cultures without cell retention. A stirred tank bioreactor with a working volume of 1.5 L was used, with an internal spin-filter with 10 µm diameter pores attached to the impeller shaft. Temperature was controlled at 37 , pH at 7.2, agitation at 80 rpm and dissolved oxygen at 50% of air saturation. The maximum cell concentration reached 15.7 x 106 cells mL-1, much higher than the cell concentration achieved in a standard batch cultivation (5 x 106 cells mL-1). Cell viability was above 90% during the 48-day cultivation period. During the batch phase of the perfusion cultivation, specific rates of glucose (qGLC) and glutamine (qGLN) consumption were 84% and 32% higher, respectively, when compared to the batch cultivation. Similarly, the specific rates of lactate (qLAC) and ammonium (qNH4) formation were 78% and 102% higher, respectively. During perfusion, the cell maintenance coefficient was not negligible and represented 83% of total glucose consumption. These data indicate that the presence of an internal spin-filter may be associated to cell stress. In perfusion, cell concentration was about 3 times higher than that in continuous culture without cell recycle. In conclusion, it was proved that suspension-adapted BHK-21 cells can be cultivated in a laboratory-scale bioreactor with an internal spin-filter, in order to achieve high cell concentrations.
 
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Data de Publicação
2014-01-10
 
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  • Fernández Núñez EG, et al. Influence of aeration-homogenization system in stirred tank bioreactors, dissolved oxygen concentration and pH control mode on BHK-21 cell growth and metabolism [doi:10.1007/s10616-013-9612-0]. Cytotechnology [online], 2013, vol. online, p. 1-13.
  • FERNÁNDEZ NÚÑEZ, EUTIMIO GUSTAVO, et al. Approach toward an efficient inoculum preparation stage for suspension BHK-21 cell culture [doi:10.1007/s10616-014-9756-6]. Cytotechnology [online], 2014, vol. June14, p. 1-10.
  • LEME, JACI, et al. A multivariate calibration procedure for UV/VIS spectrometric monitoring of BHK-21 cell metabolism and growth [doi:10.1002/btpr.1847]. Biotechnology Progress [online], 2014, vol. 30, p. 241-248.
  • NÚÑEZ, EUTIMIO GUSTAVO FERNÁNDEZ, et al. Semliki forest virus as a vector: pros and cons for its use in biopharmaceuticals production [doi:10.1590/s1516-89132013000500018]. Brazilian Archives of Biology and Technology [online], 2013, vol. 56, p. 859-866.
  • BARCELOS, J. M. M., Costa BLV, e Tonso, Aldo. Estudo cinético do crescimento de células de Drosophila melanogaster cultivadas em frascos Schott agitados. In 19. Simpósio Internacional de Iniciação Científica (SIICUSP), São Carlos, SP, 2011. Anais., 2011. Resumo.
  • Fernández Núñez EG, et al. Influence of pH and dissolved oxygen concentration on BHK-21 cell growth and metabolism in stirred tank bioreactors. In VIII Congreso Internacional de Química e Ingeniería Química, Havana, Cuba, 2012. Anais., 2012. Abstract. Available from: http://www.chemistrycuba.com/.
  • Fernández Núñez EG, et al. Optimization of inoculum preparation stage of BHK-21 cells for suspension culture in bioreactors. In XIV Reunião Científica Anual do Instituto Butantan, São Paulo, SP, 2012. Anais., 2012. Abstract.
  • Fernández Núñez EG, et al. Padronização da etapa de preparo de inóculo para biorreator usando células BHK-21 em suspensão. In V Simposio Latinoamericano de Tecnología de Cultivos Celulares (SLATCC 2012), Santa Fe, Argentina, 2012. Anais., 2012. Resumo.
  • LEME, J., et al. Growth of BHK-21 single cell suspension at different dissolved oxygen concentrations using two types of bioreactors. In VIII Congreso Internacional de Química e Ingeniería Química, Havana, Cuba, 2012. Anais., 2012. Abstract. Available from: http://www.chemistrycuba.com/.
  • LEME, J., et al. Methodology based on UV-Vis spectroscopy and partial least squares for metabolism and growth monitoring of BHK-21 cell cultures in bioreactors. In XIV Reunião Científica Anual do Instituto Butantan, São Paulo, SP, 2012. Anais., 2012. Abstract.
  • VIEIRA, P. B., Costa BLV, e Tonso, Aldo. Cultura de células de Drosophila melanogaster (S2) em processo contínuo. In IV SLATCC - Seminário Latino Americano de Tecnologia de Cultivos Celulares, Montevideo, Uruguai, 2010. Anais., 2010. Resumo.
  • VIEIRA, P. B., Costa BLV, e Tonso, Aldo. Efeitos da adição de aminoácidos em cultivos contínuos de células de Drosophila melanogaster (S2). In XVIII SINAFERM - Simpósio Nacional de Bioprocessos, Caxias do Sul, RS, 2011. Anais em CD-ROM., 2011.
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