O etanol de segunda geração (2G) é produzido aproveitando-se dos resíduos agroindustriais, florestais e até mesmo lixos municipais para a obtenção da biomassa lignocelulósica, que é previamente tratada para a liberação dos açúcares fermentescíveis para a obtenção do etanol. No entanto, a fermentação desses hidrolisados lignocelulósicos ainda enfrentam muitos desafios científicos e tecnológicos. Os processos de pré-tratamento geram uma variedade de compostos que atuam como inibidores do metabolismo dos microrganismos produtores de etanol, e assim, reduzem a eficiência da fermentação. Além dos inibidores, outro problema enfrentado tanto na produção de etanol de primeira geração (1G) quanto 2G é a presença de microrganismos contaminantes, em especial as bactérias láticas. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o impacto de inibidores presentes em hidrolisados lignocelulósicos oriundos do pré-tratamento da canade-açúcar sobre a fisiologia de bactérias láticas (LAB) contaminantes da fermentação alcoólica, na ausência e na presença de leveduras. Inicialmente foi avaliado o crescimento de LAB homo- e heterofermentativas na presença de diferentes açúcares relevantes à indústria de biocombustíveis. Nesses experimentos, foi observado que as maiores velocidades de crescimento foram obtidas em uma mistura de glicose e frutose, e somente as LAB heterofermentativas cresceram na presença de xilose. De uma forma geral, os compostos fenólicos e ácidos orgânicos apresentaram efeitos negativos sobre os dois tipos metabólicos de LAB, diminuindo a máxima velocidade específica de crescimento (µmax) em comparação ao controle, sem os inibidores. No entanto, na presença dos derivados furânicos (furfural e HMF) foi observado um estímulo do crescimento nas LAB heterofermentativas, com o aumento de µmax, de 0,296h-1 do controle para 0,309h-1 na presença de HMF e 0,414h-1 na presença de furfural. Por outro lado, nas LAB homofermentativas um efeito inibitório foi observado, com consequente redução de µmax de 0,358h-1 do controle para 0,297h-1 na presença de HMF e 0,207h-1 na presença de furfural. É provável que tanto furfural como HMF atuem nas LAB heterofermentativas como aceptores externos de elétrons, reoxidando cofatores enzimáticos e consequentemente liberando-os para reações de biossíntese, resultando no aumento de µmax. No experimento em frascos estáticos, além do aumento de µmax, foi evidenciada a diminuição da produção de lactato e o deslocamento para a produção de acetato, que diante dos inibidores tornou-se uma via mais energeticamente favorável para as LAB heterofermentativas, com fator de conversão a acetato (Yac/s) variando do controle de 0,032g/g para 0,101g/g e 0,068g/g com HMF e fufural respectivamente. Na presença de inibidores furânicos, o co-culitvo entre LAB e uma levedura industrial de Saccharomyces cerevisiae, mostrou que a LAB homofermentativa apresentou um efeito deletério maior sobre a levedura do que a LAB heterofermentativa, visto que a viabilidade celular da levedura foi de 50,3% no primeiro caso e de 71,1% no segundo, aparentemente pela concentração maior de ácido láctico na presença da homofermentativa. Avaliar a performance dessas bactérias contaminantes perante os compostos inibidores e açúcares gerados no pré-tratamento é de extrema importância, pois essas bactérias já são resistentes às condições do processo como temperatura, pH e alta concentração de etanol. Se, além de resistentes às condições do processo, também se mostrarem resistentes aos inibidores gerados no pré-tratamento e consumidoras de pentose, cuidados adicionais para o controle desses microrganismos deverão ser tomados nos processos de produção de etanol 2G.

Second generation ethanol (2G) is produced taking advantage of agro-industrial, forestry waste and even municipal waste to obtain lignocellulosic biomass, which is previously treated to release fermentable sugars to obtain ethanol. However, the fermentation of these lignocellulosic hydrolysates still faces many scientific and technological challenges. Pretreatment processes generate a variety of compounds that act as inhibitors of the metabolism of microorganisms that produce ethanol, and thus reduce the efficiency of fermentation. In addition to inhibitors, another problem faced both in the production of first generation (1G) and 2G ethanol is the presence of contaminating microorganisms, especially lactic acid bacteria. In this context, the present study aimed to evaluate the impact of inhibitors present in lignocellulosic hydrolysates from pre-treatment of sugarcane on the physiology of lactic acid bacteria (LAB) contaminating alcoholic fermentation, in the absence and presence of yeasts. Initially, the growth of homo- and heterofermentative LAB was evaluated in the presence of different sugars relevant to the biofuel industry.In these experiments, it was observed that the highest growth rates were obtained in a mixture of glucose and fructose, and only heterofermentative LAB grew in the presence of xylose. In general, the phenolic compounds and organic acids showed negative effects on the two metabolic types of LAB, decreasing the maximum specific growth rate (µmax) compared to the control, without the inhibitors. However, in the presence of furan derivatives (furfural and HMF) a growth stimulus was observed in heterofermentative LAB, with an increase in µmax, from 0.296h-1 of the control to 0.309h-1 in the presence of HMF and 0.414h-1 in the presence of furfural. On the other hand, in homofermentative LAB an inhibitory effect was observed, with a consequent reduction in µmax from 0.358h-1 of the control to 0.297h-1 in the presence of HMF and 0.207h-1 in the presence of furfural. It is likely that both furfural and HMF act on heterofermentative LABs as external electron acceptors, reoxidating enzymatic cofactors and consequently releasing them for biosynthesis reactions, resulting in an increase in µmax. In the experiment in static flasks, in addition to the increase in µmax, the decrease in lactate production and the shift towards acetate production were evidenced, which in view of the inhibitors became a more energetically favorable route for heterofermentative LAB, with a conversion factor to acetate (Yac/s) varying from the control of 0.032g/g to 0.101g/g and 0.068g/g with HMF and fufural respectively. In the presence of furan inhibitors, the co-culitve between LAB and an industrial yeast Saccharomyces cerevisiae, showed that homofermentative LAB had a greater deleterious effect on yeast than heterofermentative LAB, since the yeast cell viability was 50.3% in the first case and 71.1% in the second, apparently due to the higher concentration of lactic acid in the presence of homofermentative. Assessing the performance of these contaminating bacteria against the inhibitory compounds and sugars generated in the pre-treatment is extremely important, as these bacteria are already resistant to the process conditions such as temperature, pH and high ethanol concentration. If, in addition to being resistant to the process conditions, they are also resistant to the inhibitors generated in the pretreatment and consumers of pentose, additional care for the control of these microorganisms should be taken in the production processes of 2G ethanol.