Terapias avançadas, como a terapia gênica, têm sido amplamente estudadas para o tratamento do câncer. Muitos destes estudos baseiam-se no uso de vetores virais para a entrega de ácidos nucléicos para as células alvo. No entanto, ainda existem problemas recorrentes nesses estudos, tais como; 1) a dificuldade da entrega gênica para células tumorais devido à presença de barreiras físicas, enzimáticas e difusionais; 2) a estimulação de resposta inflamatória pelo sistema imune devido ao uso de vetores virais e; 3) os custos elevados para produção destes vetores. Uma alternativa para a superação destes obstáculos é o uso de proteínas recombinantes especificamente desenhadas para entrega gênica e combate às células tumorais. São, em geral, proteínas modulares, multifuncionais e capazes de mimetizar a habilidade dos vírus de explorar as sinalizações e respostas extra- e intracelulares para infectar as células. Dessa forma, o principal objetivo deste mestrado foi o desenvolvimento e caracterização de proteínas recombinantes multifuncionais capazes de realizarem eficientemente o transporte de material genético (RNA de interferência) para o interior de células tumorais. Para isso, a proteína repórter GFP foi fusionada a uma desintegrina (Echistatina) servindo como domínio de direcionamento para células tumorais. A proteína também contém uma poliarginina (R6) que interage e condensa o material genético a ser entregue. Quatro diferentes construções gênicas foram sintetizadas e expressas em Escherichia coli: construção 1 completa (H6-R6-GFP-ECH); construção 2 - sem Echistatina (H6-R6-GFP); construção 3 - sem a sequência R6 (H6-GFP-ECH); e construção 4 - (H6-R9-GFP-ECH), contendo a sequência R9 com potencial de induzir a formação de nanopartículas. As proteínas foram produzidas em E. coli e purificadas por cromatografia de afinidade, sem obstáculos quanto à toxicidade para a bactéria. A fluorescência das diferentes construções foi analisada e comparada. O comportamento hidrodinâmico das proteínas em solução foi também avaliado por DLS, com e sem a presença de pDNA, verificando-se assim interação com ácido nucléico e formação de nanopartículas. Estudos de atividade biológica em células in vitro indicam que a construção 1 foi capaz de direcionar e facilitar a entrada de siRNAs nas células que superexpressam receptores integrinas (células U87MG). Nos ensaios de citotoxicidade também foi demonstrado o potencial da própria proteína que, por si só, foi capaz de diminuir a viabilidade das células que super expressam integrinas, sendo ela própria um potencial agente antitumoral.

Advanced therapies such as gene therapy have been widely studied for the treatment of cancer. Many of these studies are based on the use of viral vectors for the delivery of nucleic acids to target cells. However, there are still recurring problems in these studies, such as; 1) the difficulty of gene delivery to tumor cells due to the presence of physical, enzymatic and diffusional barriers; 2) the stimulation of inflammatory response by the immune system due to the use of viral vectors and; 3) the high costs of producing these vectors. An alternative for overcoming these obstacles is the use of recombinant proteins specifically designed for gene delivery and combating tumor cells. These proteins are, in general, modular, multifunctional proteins capable of mimicking the ability of viruses to exploit extra- and intracellular signals and responses to infect cells. Thus, the main objective of this master's degree was the development and characterization of multifunctional recombinant proteins capable of efficiently carrying out the transport of genetic material (interfering RNA) into tumor cells. For this, the GFP reporter protein was fused to a disintegrin (Echistatin) serving as a targeting domain for tumor cells. The protein also contains a polyarginine (R6) that interacts and condenses the genetic material to be delivered. Four different gene constructs were synthesized and expressed in Escherichia coli: construct 1 complete (H6-R6-GFP-ECH); construct 2 - without Echistatin (H6-R6-GFP); construct 3 - without the R6 sequence (H6-GFP-ECH); and construction 4 - (H6-R9-GFP-ECH), containing the R9 sequence with the potential to induce the formation of nanoparticles. The proteins were produced in E. coli and purified by affinity chromatography, with no obstacles regarding toxicity to the bacteria. The fluorescence of the different constructs was analyzed and compared. The hydrodynamic behavior of the proteins in solution was also evaluated by DLS, with and without the presence of pDNA, thus verifying interaction with nucleic acid and formation of nanoparticles. Biological activity studies carried out in vitro indicate that construct 1 was able to direct and facilitate the entry of siRNAs into cancer cells that overexpress integrin receptors (U87MG cells). In the cytotoxicity tests, the potential of the protein itself was also demonstrated, which was capable of reducing the viability of cells that overexpress integrins, being itself a potential antitumor agent.