Tese de Doutorado

A preocupação com impactos ambientais tem levado a um aumento de interesse em bioprocessos como por exemplo a produção de bioplásticos nas últimas décadas. Contudo, a viabilidade econômica continua sendo uma barreira para uma produção mais ampla de bioplásticos como o conhecido poli-3-hidroxibuturato (PHB). Devido a isso, muitas pesquisas têm usado modelos metabólicos e ferramentas computacionais para guiar estratégias de engenharia metabólica com o intuito de melhorar a produção de PHB. No entanto, muitos desses trabalhos focam em construir cepas capazes de maior conversão para produto, sem levar muito consideração outros parâmetros importantes de bioprocesso como a concentração final do produto e a produtividade. Visto que pode haver um compromisso entre a formação de biomassa e de produto, especialmente em casos de produção associada ao crescimento, abordagens que podem acompanhar todos esses parâmetros são mais adequadas para avaliação de bioprocessos, e isso pode ser feito usando ferramentas como o Dynamic Flux Balance Analysis (DFBA). Simulações de DFBA usam modelos estequiométricos, expressões cinéticas para as reações de consumo, problema de otimização vindo de Flux Balance Analysis (FBA) para predizer fluxos internos, e equações de balanço de massa para acompanhar a concentração de metabólitos externos. Em vista disso, este trabalho apresenta uma abordagem para a avaliação do potencial de produção de produtos de interesse industrial a partir do uso de DFBA e modelos estequiométricos de escala genômica, junto a métricas adequadas de avaliação econômica. A abordagem é nomeada Simulações Dinâmicas para Avaliação do Potencial Econômico (no Inglês, DySEEP). Usando a abordagem DySEEP, a produção de PHB usando o microrganismo recombinante Cupriavidus necator, e os microrganismos Escherichia coli e Saccharomyces cerevisiae recombinantes com rota de síntese de PHB dependente do cofator NADPH ou NADH foi analisada sob condições diferentes como um estudo de caso. Através das simulações, foi possível encontrar os cenários que levariam a um fluxo de dinheiro positivo e ao lucro bruto mensal máximo teórico, e qual fonte de carbono é a mais promissora. Também através da abordagem proposta, análise econômica foi realizada para calcular as métricas clássicas de avaliação econômica como o Valor Presente Líquido, tempo de retorno, Retorno sobre Investimento, e Taxa Interna de Retorno, para cada cenário simulado. Para as simulações de produção de PHB associada ao crescimento em batelada alimentada com E. coli recombinante, foi calculado que há cenários que alcançam viabilidade econômica, e com isso, foi identificado o chamado ponto de equilíbrio (break-even point). Esta informação foi utilizada junto a um algoritmo de design de cepas chamado Minimal Cut Set, para identificar sugestões de deleções de genes que poderiam melhorar a produção de PHB, apontando então alvos para estratégias de engenharia metabólica. E para produção de PHB não associada ao crescimento, foi identificado os instantes ideais para mudança de estágio, apontando assim alvos em potencial para operação de biorreator e estratégias de biologia sintética. Esses resultados demonstram a capacidade da abordagem DySEEP em obter informações relevantes para a pré-avaliação e otimização de bioprocessos de interesse industrial.

The concern with environmental impacts has led to an increase in the interest for bioprocesses such as the production of bioplastics in recent decades. However, economic viability remains a barrier to a broader production of bioplastics such as the well-known poly-3-hydroxybutyrate (PHB). Because of this, many works using metabolic models and computational tools to guide metabolic engineering strategies to improve PHB production have been carried out. However, most of these works focused on engineering strains capable of high yields, without much consideration of other important bioprocess parameters such as product titer and productivity. Since there may be a trade-off between biomass and product formation, especially in cases of growth-associated production, approaches that can track all these important parameters are more suitable for evaluation of potential bioprocesses, and this can be done using tools such as Dynamic Flux Balance Analysis (DFBA). DFBA simulations use stoichiometric models, kinetic expressions for the uptake reactions, a Flux Balance Analysis (FBA) optimization problem for prediction of internal fluxes, and mass balance equations to track the concentrations of external metabolites. In light of that, this work presents an approach for evaluating the production potential of products of industrial interest using DFBA and genome-scale stoichiometric models, together with suitable economic evaluation metrics. The approach is named Dynamic Simulations for Evaluation of Economic Potential (DySEEP). Using the DySEEP approach, the production of PHB with recombinant Cupriavidus necator, and with recombinant Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae harboring a NADPH or NADH-dependent PHB synthesis pathway was analyzed in different conditions as a case study. With the DySEEP approach, it was possible to find the scenarios that would lead to a positive cash flow and the theoretical maximum monthly gross profit, and which carbon source is the most promising. Through the proposed approach, economic analysis was also carried out to estimate classic economic evaluation metrics such as the Net Present Value, payback time, Return on Investment, and Internal Rate of Return, for each scenario simulated. For the growth-associated fedbatch PHB production simulations with recombinant E. coli, it was calculated that there are scenarios that achieve economic viability, and with this, the so-called break-even point was identified. This information was used together with a strain design algorithm called Minimal Cut Sets to identify gene knockouts that could improve PHB production, setting therefore targets for metabolic engineering strategies. For the non-growth-associated PHB production simulations the ideal switch points were identified, setting targets for bioreactor operation and synthetic biology strategies. These results demonstrate the ability of the DySEEP approach to obtain relevant information for the pre-evaluation and optimization of bioprocesses of industrial interest.