Tese de Doutorado

Atualmente, as formulações de L-asparaginase (ASNase) são produzidas a partir de espécies de bactérias e apresentam significativa resposta de hipersensibilidade e meia-vida curta para tratamentos de leucemia linfoblástica aguda. A pegaspargase (Oncaspar®) é uma ASNase PEGuilada que superou alguns dos problemas terapêuticos atribuídos à ASNase nativa, uma vez que a forma PEGuilada reduziu drasticamente a atividade imunogênica e aumentou o tempo de circulação na corrente sanguínea. O processo de PEGuilação é uma ferramenta importante para melhorar o perfil de qualidade dos biofármacos. Contudo, a Oncaspar® é obtida por reação de PEGuilação aleatória, produzindo variações lote-a-lote, o que são indesejáveis para controle de qualidade de produção de biofármaco. A crisantaspase (CRIS), ASNase de Dickeya chrysanthemi, é uma alternativa terapêutica promissora para pacientes refratários aos tratamentos com ASNase, sendo que previamente Pichia pastoris GlycoSwitch® foi utilizada como sistema de expressão para produzir uma crisantaspase com um padrão de glicosilação humanizada. Neste trabalho, as linhagens P. pastoris HIS+ e HIS- foram comparadas por meio de ferramentas estatísticas no que tange à eficiência na produção de biomassa, proteínas totais e enzima CRIS; para uma mesma concentração celular a linhagem P. pastoris HIS+ produziu um valor médio expressivamente maior. Assim, produzimos e purificamos a CRIS pelo cultivo de P. pastoris GlycoSwitch® e realizamos uma PEGuilação sítio dirigida na região N-terminal da enzima, com o objetivo de colaborar com o projeto temático Fapesp (Processo 13/08617-7) para produção nacional de uma ASNase com melhores propriedades físico-químicas, farmacocinéticas, termodinâmicas e biológicas. Em colaboração com esse projeto, esta tese objetiva também realizar os ensaios termodinâmicos para avaliar os efeitos da PEGuilação na temperatura ótima e na termoinativação e desnaturação irreversível de proteoformas obtidas por meio de PEGuilação sítio dirigida N-terminal da CRIS com os derivados m-PEG-NHS (20 kDa) de cadeia linear e ramificado. A partir dos resultados desses ensaios termodinâmicos foi sugerido que a adição de quatro cadeias de PEG à enzima crisantaspase glicosilada contribuiu com o aumento da variação de entalpia de desnaturação (H°u) e não prejudicou de forma expressiva a mobilidade conformacional. O processo de glicosilação diminuiu o acesso do PEG a região N-terminal, e por sua vez, o rendimento. Os resultados sugerem que o processo de glicosilação também aumentou a estabilidade CRIS-PEGLinear, em temperatura de refrigeração à 4°C. Em condições fisiológicas à 37°C uma maior densidade eletrônica conferida ao PEGRamificado preveniu flutuações conformacionais induzidas pelo calor. A viabilidade terapêutica da CRIS-PEGRamificada a torna promissora quando consideramos a possibilidade do desenvolvimento de uma formulação para melhorar a estabilidade em condições refrigeradas; assim, contribuiu para o desenvolvimento de L-asparaginases inovadoras com potencial de se tornarem biofármacos com produção nacional.

L-asparaginase (ASNase) formulations are currently produced from bacteria species and present higher hypersensitivity response and short half-life for acute lymphoblastic leukemia treatments. The pegaspargase (Oncaspar®) is an ASNase PEGyted that overcame some of therapeutical problems attributed to native ASNase, since the PEGylated form drastically reduced immunogenic activity and increased circulation time in the bloodstream. The PEGuilation process is an important tool to improve the quality profile of biopharmaceutical drugs. However, Oncaspar® is obtained by a random PEGylation reaction, producing batch-to-batch variations, which are undesirables for quality control of biopharmaceutical production. Chrysantaspase (CRIS), an ASNase from Dickeya chrysanthemi, is a promising therapeutic alternative for patients who are refractory to conventional ASNase treatments. Previously, Pichia pastoris GlycoSwitch® was used as an expression system to produce a chrysantaspase with a humanized glycosylation pattern. In this work, the P. pastoris HIS+ and HIS- strains were compared using statistical tools regarding their efficiency in biomass production, total protein expression, and CRIS enzyme yield for the same cell concentration, the P. pastoris HIS+ strain produced a significantly higher mean value. We produced and purified CRIS through the cultivation of P. pastoris GlycoSwitch® and performed a site-directed PEGylation at the Nterminal region of the enzyme. This was carried out with the aim of contributing to the thematic project (Process No. 13/08617-7) focused on the national production of an ASNase with improved physicochemical, pharmacokinetic, thermodynamic, and biological properties. In collaboration with this project, this thesis aims to perform thermodynamic assays to evaluate the effects of PEGylation on the optimal temperature, thermal inactivation, and irreversible denaturation of proteoforms obtained through site-directed N-terminal PEGylation of CRIS using linear and branched mPEG-NHS (20 kDa) derivatives. Based on the results of these thermodynamic assays, it was suggested that the addition of four PEG chains to the glycosylated chrysantaspase contributed to an increase in unfolding enthalpy change (H°u) without significantly impairing conformational mobility. The glycosylation process reduced PEG accessibility to the N-terminal region and, consequently, the yield. The results also suggest that glycosylation enhanced the stability of CRIS-PEGLinear at refrigeration temperature (4°C). Under physiological conditions (37°C), the higher electron density conferred by the branched PEG prevented heat-induced conformational fluctuations. The therapeutic viability of CRIS-PEGBranched makes it a promising candidate when considering the development of a formulation aimed at improving stability under refrigerated conditions. Thus, this work contributes to the development of innovative L-asparaginases with the potential to become biopharmaceuticals produced domestically.