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Dissertação de Mestrado
DOI
https://doi.org/10.11606/D.3.2020.tde-05042021-090819
Documento
Autor
Nome completo
Karina Klafke
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2020
Orientador
Banca examinadora
Tonso, Aldo (Presidente)
Jorge, Soraia Attie Calil
Moraes, Ângela Maria
Título em português
Desenvolvimento do processo de produção em biorreator do bioinseticida Spodoptera frugiperda MNPV em células de inseto Sf-9.
Palavras-chave em português
Baculoviridae
Bioinseticida
Produção in vitro
Reatores bioquímicos
Spodoptera frugiperda
Resumo em português
O Brasil é um dos maiores produtores e exportadores de milho do mundo, portanto danos ao cultivo podem trazer um prejuízo econômico considerável. A Spodoptera frugiperda é a praga mais comum de milho nas Américas e os baculovírus são patógenos naturais desta, podendo atuar como bioinseticidas. Atualmente, são empregadas estratégias in vivo para produção em escala comercial através da multiplicação do vírus no próprio inseto hospedeiro em instalações de biofábricas, no entanto, a alternativa de produção in vitro em cultura de células de insetos em larga escala por meio de biorreatores pode trazer vantagens econômicas. Neste estudo buscou-se desenvolver o processo de produção in vivo de SfMNPV através do estudo de diferentes multiplicidades de infecção (MOI) e suplementações nutricionais, análises morfológica e molecular da infecção e testes do efeito da diminuição de cisalhamento no crescimento e produção de vírus. O projeto foi desenvolvido em uma parceria da Escola Politécnica da Universidade de São Paulo (GEnBio-USP) com a EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia (Cenargen) e com o United States Department of Agriculture (Laboratório NRS-FS/USDA). Os experimentos foram feitos com células Sf-9 em meio de cultivo Sf-900 III e ExCell 420 em frascos e em biorreatores STR aspergido, STR bubble free e Wave. De início, testou-se uma série de suplementações para o meio de cultivo ExCell 420 e definiu-se que a melhor condição dentre as avaliadas foi a combinação da adição de 2 g/L de glicose e 200 mg/L de ácido cisteico, que elevou a densidade celular em 37,5%, resultando em uma concentração celular máxima de 8,8x106 cel/mL em frasco shaker. Já para o meio de cultivo Sf-900 III, foi definida a adição de 1,0 g/L de glutamina nos ensaios em biorreator. Os cultivos em biorreator STR aspergido tiveram média de velocidade específica de crescimento máxima (µmáx) de 0,60 dia-1. Cultivos em STR bubble free apresentaram impacto significativo no valor da concentração celular máxima (Xvmáx), atingindo valores de 10x106 cel/mL, representando aumento de 42,8% comparada à abordagem STR aspergido, acompanhada de queda no µmáx para 0,30 dia-1. Da mesma forma, cultivos em reator Wave com meio ExCell 420 apresentaram, em média, aumento de 42,5% em Xvmáx comparada com o equivalente em STR e µmáx em torno de 0,45 dia-1. Estes dados corroboram o efeito do cisalhamento como importante fonte de estresse celular. A análise metabólica dos ensaios com meio de cultivo Sf-900 III foram ao encontro de dados da literatura, confirmando a eficiência no metabolismo via ciclo TCA para células Sf-9, entretanto, devido a valores levemente aumentados de concentração de amônio, supõe-se que possa estar ocorrendo fenômeno reportado como efeito de densidade, em que há perda de eficiência metabólica devido a inibição por alta concentração celular. Ademais, observou-se também aumento de consumo de glicose pós infecção. Por fim, a otimização da etapa de crescimento celular levou à melhora significativa na etapa de produção viral. Em ensaios de biorreator foi confirmado MOI de 1,0 como parâmetro otimizado sem alterações genéticas virais. Cultivo em biorreator STR aspergido com meio ExCell 420 obteve produção de 6x1010 pol/L, em comparação com seu equivalente em Wave de 43x1010 pol/L, que teve a melhor reprodutibilidade do estudo. Contudo, a abordagem de STR aspergido em meio de cultura Sf-900 III combinado ao MOI de 1,0 e suplementação com glutamina foi a que apresentou melhor desempenho de produção viral com produtividade específica acima de 300 pol/cel e volumétrica de 9x1011 pol/L.
Título em inglês
Development of the bioinsecticide production process in bioreactor for Spodoptera frugiperda MNPV in Sf-9 insect cells.
Palavras-chave em inglês
Baculovirus
Biopesticide
Bioreactor
In vitro production
Sf-9
SfMNPV
Spodoptera frugiperda
Resumo em inglês
Brazil is one of the world biggest producers and exporters of corn crop, hence cultivation damage can bring a substantial prejudice. Spodoptera frugiperda is America's most common corn pest and baculoviruses are natural pathogens of this pest and can act as a biopesticide. Currently, in vivo strategies for commercial scale are employed by multiplying the virus in the host insect in biofactory facilities, however, in vitro large-scale production alternative can bring economic advantages. This study pursued to develop the process of in vivo production of SfMNPV through the study of different multiplicities of infection (MOI) and nutritional supplements, morphological and molecular analysis of the infection and tests of the effect of decreasing shear stress on the growth and production of virus. This project was developed through a partnership between the Polytechnic School of University of São Paulo (GenBio-USP) with EMBRAPA Genetic Resources and Biotechnology (Cenargen) and the United States Department of Agriculture (NRS-FS/USDA). The determinations were accomplished in Sf-9 insect cells in Sf-900 III and ExCell 420 culture media and performed in flasks and STR with aspersion, STR bubble free and Wave bioreactor models. At first, a series of supplementations were tested in the ExCell 420 culture medium and it was defined that the best condition among those evaluated was the combination of the addition of 2 g/L of glucose and 200 mg/L of cysteic acid, which increased cell density by 37.5%, resulting in a maximum cell concentration of 8.8x106 cell/mL in shaker flasks. As for the Sf-900 III culture medium, 1 g/L of glutamine was added. Batches in sparged STR bioreactor had an average maximum specific growth rate (µmax) of 0.60 day-1. Tests in STR bubble free showed a significant impact on the maximum cell concentration (Xvmax) value, reaching values of 10x106 cell/mL, representing a 42.8% increase compared to the sparged STR approach, which was accompanied by a drop in µmax to 0.30 day-1. Likewise, cultures in the Wave reactor with ExCell 420 medium showed, on average, a 42.5% increase in Xvmax compared to the equivalent in STR and µmax around 0.45 day-1. These data corroborate the effect of shear as an important source of cellular stress. The metabolic analysis of the batches with Sf-900 III culture medium met with data from the literature, confirming the metabolic efficiency via TCA cycle in Sf-9 cells, however, due to slightly increased values of ammonium concentration, it is assumed that a phenomenon reported as density effect, in which there is loss of metabolic efficiency due to inhibition by high cell concentration, may be occurring. In addition, an increase in glucose consumption was also observed in a post-infection manner. Finally, the optimization of the cell growth stage led to a significant improvement in the viral production stage. In bioreactor tests, a MOI of 1.0 was confirmed as an optimized parameter without viral genetic alterations. Batches in sparged STR bioreactor with ExCell 420 medium yielded 6x1010 pol/L, compared to its Wave equivalent of 43x1010 pol/L, which had the best reproducibility in the study. However, the sparged STR approach with Sf-900 III culture medium combined with the MOI of 1.0 and glutamine supplementation showed the best viral production performance with specific productivity above 300 pol/cell and volumetric productivity of 9x1011 pol/L.
 
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KarinaKlafkeCorr20.pdf (12.31 Mbytes)
Data de Publicação
2021-04-05
 
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