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Thèse de Doctorat
DOI
https://doi.org/10.11606/T.25.2020.tde-25102021-151326
Document
Auteur
Nom complet
Nara Lígia Martins Almeida
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
Bauru, 2020
Directeur
Jury
Lara, Vanessa Soares (Président)
Ponce, Jose Burgos
Santiago Junior, Joel Ferreira
Sforcin, Jose Mauricio
Titre en portugais
Avaliação da atividade antimicrobiana e imunomodulatória de Punica granatum Linné em dois modelos experimentais in vivo de candidose
Mots-clés en portugais
Anfotericina B
Candidíase Bucal
Candidíase Invasiva
Fluconazol
Romã (Fruta)
Resumé en portugais
O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antifúngica e imunomodulatória do extrato hidroalcoólico das cascas de Punica granatum Linné em dois modelos experimentais in vivo de candidose (sistêmica e oral). Paralelamente, a presença de efeitos adversos nas administrações diárias de P. granatum foi avaliada. Testes estatísticos foram aplicados de acordo com a presença ou não de normalidade em todas as avaliações, considerando p<0,05. No modelo sistêmico, após a seleção das concentrações não tóxicas de P. granatum e de anfotericina B nas larvas de G. mellonella, foram realizados dois desenhos experimentais: profilaxia pela inoculação intra-hemocele de uma dose única de extrato, 24 horas antes da infecção por C. albicans, e terapia pela inoculação de dose única 1 hora após a infecção fúngica. Como controle, as larvas foram infectadas/não tratadas, tratadas com anfotericina B ou não infectadas/não tratadas. Ambos os tratamentos foram eficazes contra a infecção por C. albicans por meio de curvas de sobrevivência. No entanto, o efeito profilático de P. granatum resultou em maior tempo de sobrevivência do que a terapia. Na sequência, doses múltiplas do extrato foram administradas em larvas antes da infecção, resultando em maior porcentagem de sobrevivência e maior densidade de hemócitos quando comparadas às larvas infectadas e não tratadas. No modelo localizado, o perfil fitoquímico e a CIM do extrato e fluconazol foram avaliados in vitro. Para análise toxicológica, camundongos BALB/c receberam o extrato a 150 ou 300 mg/Kg, ou fluconazol a 100 mg/Kg, por gavagem, durante 7 dias. Como controle, água foi administrada. O screnning hipocrático e o peso dos animais foram mensurados diariamente. Após a eutanásia, baço, fígado e rins foram analisados microscopicamente; e marcadores bioquímicos séricos foram quantificados. Para análise antimicrobiana, animais imunossuprimidos foram infectados por C. albicans em toda cavidade oral e, após 7 dias, receberam 7 doses diárias de P. granatum. Para controle, animais infectados receberam água ou fluconazol, bem como animais não foram infectados. O peso corporal foi mensurado diariamente. Após eutanásia, baço, fígado e rins foram pesados e analisados microscopicamente, e a língua foi avaliada macroscópica, microbiológica e microscopicamente. Para análise imunomodulatória, a produção de citocinas foi mensurada nos homogenatos de linfonodos cervicais e língua por Milliplex®. Como resultado, foi identificado em P. granatum o composto punicalagina e a CIM foi mensurada em 18,75 mg/mL. Animais saudáveis que receberam fluconazol apresentaram redução do peso corporal, hepatotoxicidade e nefrotoxicidade, e aumento de TGP e triglicerídeos, diferentemente dos grupos tratados com P. granatum. A placa micelial formada na língua foi atenuada póstratamento com P. granatum ou fluconazol, acarretando na redução do número de UFC/g; consequentemente, os escores microscópicos foram mais baixos na língua dos animais tratados em relação aos controles. Ainda, o tratamento com o extrato demonstrou ser hepatoprotetor e, possivelmente, anti-inflamatório, pelo aumento de IL-10 e TGF-1, em relação aos controles da infecção. Concluindo, em ambos os modelos experimentais in vivo de candidose sistêmica e localizada, o extrato de P. granatum atuou como potente agente antimicrobiano contra C. albicans e desempenhou papel protetor, não tóxico e imunomodulador no tratamento da candidose.
Titre en anglais
Evaluation of the antimicrobial and immunomodulatory activity of Punica granatum Linn. in two in vivo experimental models of candidiasis
Mots-clés en anglais
Amphotericin B
Fluconazole
Invasive Candidiasis
Oral Candidiasis
Pomegranate
Resumé en anglais
The aim of this work was to evaluate the antifungal and immunomodulatory activity of the hydroalcoholic extract of the peels of Punica granatum Linn. in two in vivo experimental models of candidiasis (systemic and oral). In parallel, the presence of side effects in the daily administrations of P. granatum was evaluated. Statistical tests were applied according to the presence or not of normality in all evaluations, considering p <0.05. In the systemic model, after selecting the non-toxic concentrations of P. granatum and amphotericin B in the larvae of G. mellonella, two experimental designs were performed: prophylaxis by intra-hemocele inoculation of a single dose of extract, 24 hours before infection with C. albicans, and therapy by inoculation of a single dose 1 hour after fungal infection. As a control, the larvae were infected/untreated, treated with amphotericin B or uninfected/untreated. Both treatments were effective against C. albicans infection through survival curves. However, the prophylactic effect of P. granatum resulted in a longer survival time than therapy. Subsequently, multiple doses of the extract were administered to larvae before infection, resulting in a higher percentage of survival and a higher density of hemocytes when compared to infected and untreated larvae. In the localized model, the phytochemical profile and MIC of the extract and fluconazole were evaluated in vitro. For toxicological analysis, BALB/c mice received the extract at 150 or 300 mg/Kg, or fluconazole at 100 mg/Kg, by gavage, for 7 days. As a control, water was administered. Hippocratic screening and animal weight was measured daily. After euthanasia, spleen, liver and kidneys were analyzed microscopically; and serum biochemical markers were quantified. For antimicrobial analysis, immunosuppressed animals were infected with C. albicans on entire oral cavity and, after 7 days, received 7 daily doses of P. granatum. For control, infected animals received water or fluconazole, and animals were not infected. Body weight was measured daily. After euthanasia, the spleen, liver and kidneys were weighed and analyzed microscopically, and the tongue was evaluated macroscopically, microbiologically and microscopically. For immunomodulatory analysis, cytokine production was measured in the homogenates of cervical lymph nodes and tongue by Milliplex®. As a result, the punicalagin compound was identified in P. granatum and the MIC was measured at 18.75 mg/mL. Healthy animals that received fluconazole showed reduced body weight, hepatotoxicity and nephrotoxicity, and increased TGP and triglycerides, differently from groups treated with P. granatum. The mycelial plaque formed on the tongue was attenuated after treatment with P. granatum or fluconazole, resulting in a reduction in the number of CFU/g; consequently, the microscopic scores were lower in the tongue of the treated animals compared to the controls. Still, the treatment with the extract proved to be hepatoprotective and, possibly, anti-inflammatory, due to the increase production of IL-10 and TGF-1, in relation to infection controls. In conclusion, in both in vivo experimental models of systemic and localized candidiasis, P. granatum extract acted as a potent antimicrobial agent against C. albicans and played a protective, non-toxic and immunomodulatory role in the treatment of candidiasis.
 
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Date de Libération
2023-10-25
Date de Publication
2021-10-25
 
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