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Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/T.25.2020.tde-04102021-161059
Documento
Autor
Nome completo
Mariel Tavares de Oliveira Prado Bergamo
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Bauru, 2020
Orientador
Banca examinadora
Valarelli, Thais Marchini de Oliveira (Presidente)
Araujo, Fernando Borba de
Machado, Maria Aparecida de Andrade Moreira
Nor, Jacques Eduardo
Título em inglês
Relation between the function and expression of VEGFR1 and the vasculogenic differentiation of dental pulp stem cells
Palavras-chave em inglês
Angiogenesis
Stem Cells
Tissue Engineering
Vascular Endothelial Growth Factor
Resumo em inglês
This study aimed to evaluate the role of the Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 1 (VEGFR1) expression at the endothelial differentiation of Dental Pulp Stem Cell (DPSC) and Stem Cell from human deciduous tooth (SHED). Cells were sorted by High (positive/ VEGFR1HIGH) and Low (negative/VEGFR1LOW) levels of VEGFR1 expression through Flow Cytometry and cultured in alpha-MEM supplemented with 20% Fetal Bovine Serum (FBS) or Endothelial Growth Medium (EGM2-MV) with 50ng/mL rhVEGF (control or differentiation medium) and 0 or 25g/mL of Bevacizumab (Avastin or Bevacizumab). The following tests were performed in vitro to evaluate cell proliferation and endothelial differentiation of stem cells: SRB, Sprouting Assay, RT-PCR, Western Blot, and Immunofluorescence. To evaluate this process in vivo, scaffolds seeded with SHED expressing high and low levels of VEGFR1 were transplanted into the subcutaneous dorsum of immunodeficient mice and after 28 days the samples were retrieved for, HE staining, immunohistochemistry, and immunofluorescence. The new blood microvessels formation were counted through ImageJ software, the statistical analyses were performed using unpaired T Test or One-Way ANOVA followed by Tukey Test, and the threshold of statistical significance was set at p < 0.05. The results showed that the SHED VEGFR1LOW has more proliferation rate in 72h regardless of culture media. The differentiation of SHED/DPSC in endothelial-like cells in vitro was confirmed through the expression of endothelial cells markers and sprouting formation by those cells. SHED VEGFR1HIGH generated more quantity of sprouts in vitro and more quantity of microvessel in vivo, showing the important role of this receptor in vasculogenic differentiation of SHED and DPSC.
Título em português
Relação entre a função e expressão do VEGFR1 e a diferenciação vasculogênica de células-tronco da polpa dentária
Palavras-chave em português
Angiogênese
Células-Tronco
Engenharia Tecidual
Fator de Crescimento Endotelial Vascular
Polpa Dentária
Resumo em português
O objetivo desse estudo foi avaliar o papel da expressão do Receptor 1 do Fator de Crescimento Endotelial Vascular (do inglês Vascular Endothelial Growth Factor 1 VEGFR1) na diferenciação das células-tronco da polpa dentária (do inglês Dental Pulp Stem Cell DPSC) e Células-tronco de dentes decíduos humanos esfoliados (do inglês Stem cell from Human Exfoliated Deciduous tooth SHED) em células endoteliais. Células foram separadas em células com alta (positivo/VEGFR1HIGH) e baixa (negativo/VEGFR1LOW) expressão do VEGFR-1 através de Citometria de Fluxo e cultivadas em alphaMEM suplementado com 20% de Soro Fetal Bovino (SFB) ou Meio de Crescimento Endotelial (EGM2-MV) suplementado com 50ng/mL de rhVEGF (controle ou meio de diferenciação) e 0 ou 25g/mL de Bevacizumab (Avastin® ou Bevacizumab). Os outros testes foram feitos in vitro para avaliar a proliferação celular e a diferenciação endotelial das células-tronco: SRB, ensaio de formação tubular, RT-PCR, Western Blot e Imunofluorescência. Para avaliar esse processo in vivo, matrizes receberam SHED com altos e baixos níveis de expressão de VEGFR1 e foram transplantadas para a região subcutânea do dorso de ratos imunocomprometidos e depois de 28 dias as amostras foram retiradas e ensaios de HE, imunohistoquímica e imunofluorescência foram realizados. A contagem de novos vasos sanguíneos foi feita no software ImageJ e as análises estatísticas foram feitas usando Teste T não pareado ou ANOVA a um critério seguido pelo Teste de Tukey e a significância estatística foi considerada p<0,05. Os resultados mostraram que SHED VEGFR1LOW teve maior taxa de proliferação no período de 72h independente do meio de cultura. A diferenciação de SHED/DPSC em células endoteliais in vitro foi confirmada através da expressão de marcadores de células endoteliais e formação de brotamentos por essas mesmas células. SHED VEGFR1HIGH apresentou maior formação de brotamentos in vitro e maior quantidade de microvasos sanguíneos in vivo, mostrando o importante papel deste receptor na diferenciação vasculogênica da SHED e DPSC.
 
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Data de Publicação
2021-10-04
 
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