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Master's Dissertation
DOI
https://doi.org/10.11606/D.23.2020.tde-27082021-153952
Document
Author
Full name
Natália Pieretti Bueno
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2020
Supervisor
Committee
Ferraz, Emanuela Prado (President)
Deboni, Maria Cristina Zindel
Marques, Marcia Martins
Rosa, Adalberto Luiz
Title in Portuguese
Efeito da terapia de fotobiomodulação na diferenciação osteoblástica de células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea de ratos diabéticos
Keywords in Portuguese
Celula-tronco mesenquimal
Diabetes melittus
Osso
Osteoblasto
Terapia de fotobiomodulação
Abstract in Portuguese
Estratégias de engenharia de tecido e de terapia celular têm sido empregadas no tratamento de defeitos ósseos com resultados promissores. Contudo, a reconstrução de defeitos ósseos em indivíduos portadores de Diabetes Mellitus (DM) continua um desafio. O DM é uma doença metabólica crônica caracterizada por hiperglicemia que, em última análise, aumenta o estresse oxidativo celular e resulta na diminuição da diferenciação e/ou atividade de células-tronco mesenquimais (CTMs), sugerindo que CTMs autólogas podem não ser uma alternativa de tratamento para esses pacientes. Assim, estrate?gias para recuperar seu potencial osteoge?nico poderiam otimizar os resultados da terapia celular. A fotobiomodulac?a?o (FBM) e? um tratamento na?o invasivo que diminui o estresse oxidativo, sendo relacionado a? diminuic?a?o do estado hiperglice?mico e acelerac?a?o do processo de reparo o?sseo. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da FBM no potencial osteoge?nico de CTMs derivadas da medula óssea de animais diabéticos. O DM foi induzido em ratos Wistar machos pela injeção intraperitoneal de estreptozocina (60 mg/Kg). Como Controle foram utilizados animais saudáveis submetidos à injeção de solução tampão. Após 30 dias, os fêmures foram removidos para caracterização microtomográfica, morfométrica e para obtenção de células. As células foram cultivadas em meio osteogênico para diferenciação em osteoblastos derivados de animais saudáveis (OB) e diabéticos (OB-DM) e as OB-DM foram irradiadas a cada 72 horas (660 nm; 0,14 J; 20 mW; 0,714 W/cm2 ; 5 J/cm2 ) (OBDM-FBM). A morfologia celular foi avaliada em 24 e 72 horas e a viabilidade celular aos 4, 7 e 10 dias (MTT). O potencial osteogênico foi avaliado pela atividade de fosfatase alcalina (ALP) aos 7 e 14 dias; expressão proteica dos marcadores ósseos ALP, fator de transcrição relacionado ao Runt-2 (RUNX2) e osteopontina (OPN) aos 7 dias; expressão de genes marcadores ósseos Alp, sialoproteína óssea (Bsp), Runx2 e Opn aos 10 dias; e produção de matriz extracelular mineralizada aos 17 dias. Os dados foram comparados por teste t e ANOVA com um ou dois fatores seguido do Student-Newman Keus, quando indicado. O nível de significância adotado foi de 5%. O DM resultou em alteração na arquitetura óssea e diminuição dos parâmetros morfométricos avaliados. OB-DM são menores e menos espraiadas quando comparadas às células saudáveis, enquanto OB-DM-FBM apresentam morfologia similar aos OBs. A viabilidade celular variou de acordo com o tempo e grupo experimental, com aumento da viabilidade em OB-DM-FBM aos 10 dias. OB-DM apresentaram menor atividade de ALP, menor expressão proteica de ALP e OPN, menor expressão dos genes Alp, Runx2, Bsp, Opn e menor produção de matriz extracelular mineralizada. Por outro lado, a terapia de FBM aplicada nas células diabéticas resultou em aumento da atividade de ALP, quantidade de OPN, expressão dos genes Alp, Bsp e Opn e na produção de matriz extracelular, quando comparadas às OB-DM. Nossos resultados confirmaram que o DM diminui a diferenciação osteoblástica de CTMs diabéticas e que a FBM recupera esse potencial osteogênico, contribuindo para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para o tratamento de defeitos ósseos em pacientes diabéticos.
Title in English
The effect of photobiomodulation therapy on osteoblast differentiation of mesenchymal stem cells derived from bone marrow of diabetic rats
Keywords in English
Bone
Diabetes
Osteoblast
Photobiomodulation therapy
Stem cell
Abstract in English
Bone tissue engineering and cell-based therapy for bone regeneration might be impaired by Diabetes Mellitus (DM) due to negative effects on differentiation and activity of mesenchymal stem cells (MSCs). DM is a chronic metabolic disease characterized by hyperglycemia, which increases cellular oxidative stress and affects the activity and differentiation of mesenchymal stem cells (MSCs), suggesting that autologous MSCs may not be an alternative treatment for these patients. Thus, strategies to recover their osteogenic potential could optimize the cell therapy results. Photobiomodulation (PBM) therapy is a non-invasive treatment that decreases oxidative stress and has been related to a decrease of the hyperglycemic state and acceleration of the bone repair process. This study aimed to evaluate the effect of PBM on the osteogenic potential of bone marrow MSCs (BM-MSCs) derived from diabetic animals. DM was induced in male Wistar rats using streptozotocin (60 mg/kg). Healthy animals were used as Control. After 30 days, the femurs were removed for microtomographic and morphometric characterization. BM-MSCs of healthy and diabetic rats were isolated and differentiated into osteoblasts (OB and OB-DM). OBDM were treated with PBM every 72 h (660 nm; 0.14 J; 20 mW; 0.714 W/cm2, and 5 J/cm2) (OB-DM-PBMT). These cells were evaluated for cell morphology at 24 and 72 hours and cell viability on days 4, 7 and 10 (MTT). The osteogenic potential was evaluated by alkaline phosphatase (ALP) activity on days 7 and 14; ALP, runt-related transcription factor (RUNX2) and osteopontin (OPN) protein expression on day 7; Alp, bone sialoprotein (Bsp), Runx2 and Opn gene expression on day 10; and production of mineralized extracellular matrix on day 17. Data were compared by t-test and two or one-way ANOVA followed by Student-Newman Keus when appropriated. The significance level was 5%. DM resulted in changes in bone architecture and decreased all the evaluated morphometric parameters. OB-DM were smaller and less spread compared to OB, while OB-DM-PBM presented a cell morphology resembling OB. Cell viability varied according to time and experimental group, with increased viability in OB-DM-PBM at 10 days. DM decreased the ALP activity, ALP and OPN protein expression, Alp, Runx2, Bsp, Opn gene expression, and the production of the extracellular mineralized matrix compared to OB. On the other hand, diabetic cells treated with PBM exhibited an increase in ALP activity, the amount of OPN protein, the Alp, Bsp and Opn gene expression and in the production of extracellular matrix, compared to OB-DM. Our results may contribute to the development of therapeutic approaches to optimize the treatment of bone defects in patients with DM.
 
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Publishing Date
2021-09-24
 
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