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Thèse de Doctorat
DOI
https://doi.org/10.11606/T.23.2021.tde-27082021-151611
Document
Auteur
Nom complet
Natacha Kalline de Oliveira
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
São Paulo, 2021
Directeur
Jury
Deboni, Maria Cristina Zindel (Président)
Prado, Flávia Cristina Rosin
Rodrigues, Marcela Charantola
Sendyk, Daniel Isaac
Titre en portugais
Desempenho de discos de poli ?-caprolactona/poli (rotaxano) funcionalizados por células tronco de polpa dentária humana na angiogênese: ensaio em membrana corioalantóica
Mots-clés en portugais
Células tronco
Efeito angiogênico
Membrana corioalantóica
Polímeros
Resumé en portugais
As terapias regenerativas abrem grandes possibilidades para as grandes reconstruções ósseas. A engenharia de biomateriais tem um papel importante nesse cenário, mais precisamente com o desenvolvimento de estruturas que forneçam um ambiente favorável para a proliferação e diferenciação de células residentes ou implantadas na região receptora para a neoformação óssea. Há seis anos trabalhamos em parceria com o Departamento de Materiais da Faculdade de Engenharia Mecânica da UNICAMP para a caracterização biológica de um biomaterial composto por uma blenda polimérica de poli ?-caprolactona/poli (rotaxano), que apresentou potencial para ser funcionalizada por células tronco de polpa dentária humana com diferenciação osteogênica. O sucesso da bioengenharia de substitutos de novos tecidos depende de rápida e adequada angiogênese para que ocorra suprimento de oxigênio e de nutrientes para a sobrevida das células. O objetivo deste estudo foi verificar o desempenho de discos de blenda polimérica de poli ?-caprolactona/poli (rotaxano) funcionalizados por células tronco de polpa dentária humana no processo de vascularização por meio de um ensaio em membrana corioalantóica. Células tronco de polpa dentária humana (hDPSCs) foram cultivadas por 14 dias a partir de amostras congeladas e re-caracterizadas. Para este ensaio, utilizamos ovos de galinha fertilizados no 3º dia embrionário. Foram removidos 2mL de albumina e a confeccionada abertura nas cascas de todos os ovos. No 7º dia embrionário sobre a membrana corioalantóica (MCA) dos ovos que apresentavam sinal visível de fecundação e embrião viável, foram depositados os insertos do experimento distribuídos nos grupos: Policlono, onde as células cultivadas em meio clonogênico por 14 dias foram semeadas sobre discos do polímero; Polimin, onde as células semeadas foram cultivadas em meio mineralizante por 14 dias; Poli no qual foi inserido apenas o disco de polímero sem semeadura celular; controle positivo apenas com inserto de hDPSCs na mesma densidade das semeaduras anteriores e controle negativo sem células e sem biomaterial para normatizar o padrão vascular sem intervenções. No 14º dia embrionário as aberturas nas cascas foram ampliadas e foram realizadas imagens digitais padronizadas para avaliação macroscópica da vascularização. As MCAs de todos os ovos foram removidas para análise histológica por meio de coloração por Hematoxilina-Eosina para avaliação microscópica da angiogênese. Colorações imuno-histoquímicas para anticorpos CD34 e Actina músculo liso (AML) e de imunofluorescência para Lamin-A foram utilizadas de foram representativas da presença das células endoteliais, dos vasos sanguíneos e das hDPSCs respectivamente. Os resultados mostraram que ocorreu aumento do número de vasos e intersecções e uma correspondência histológica da angiogênese na presença do conjunto poli ?-caprolactona/poli (rotaxano)/hDPSCs. Foi possível observar ainda que as células indiferenciadas pareceram estimular a angiogênese de forma mais intensa quando comparado às células diferenciadas. A blenda de poli ?-caprolactona/poli (rotaxano) possui potencial de estimular a angiogênese especialmente quando funcionalizada por células tronco e desempenho promissor como biomaterial bioativo para bioengenharia nas terapias regenerativas.
Titre en anglais
Performance of poly ?-caprolactone / poly (rotaxane) disks functionalized with human dental pulp stem cells in angiogenesis: a chorioallantoic membrane assay
Mots-clés en anglais
Angiogenesis Effect
Chorioallantoic Membran
Polymers
Stem cells
Resumé en anglais
Regenerative therapies open great possibilities for large bone reconstructions. Biomaterial engineering plays an important role in this scenario, more precisely with the development of structures that provide a favorable environment for the proliferation and differentiation of cells residents or implanted in a receptor region for bone neoformation. For six years, we have been working in partnership with the Materials Department of the Faculty of Mechanical Engineering of UNICAMP for the biological characterization of a biomaterial composed of a polymeric blend of poly ?caprolactone/poly (rotaxane), which presented the potential to be functionalized by human dental pulp stem cells and osteogenic differentiation. The success of bioengineering of new tissue substitutes depends on rapid and adequate angiogenesis for the supply of oxygen and nutrients for cell survival. The objective of this study was to verify the performance of polymeric blend discs of poly ?caprolactone/poly (rotaxane) functionalized by human dental pulp stem cells in the vascularization process by means of a chorioallantoic membrane assay. Human dental pulp stem cells (hDPSCs) were cultured for 14 days from frozen and recharacterized samples. For this trial, on the 3rd embryonic day of fertilized chicken eggs, 2mL of albumin was removed and the opening was made in the shells of all eggs. On the 7th embryonic day on the chorioallantoic membrane (MCA) of the eggs that presented visible sign of fertilization and viable embryo, the inserts of the experiment were deposited in the groups: Polyclon- where the cells cultivated in clonogenic medium for 14 days were sown on polymer discs; Polimin- where the seed cells were grown in mineralizing medium for 14 days; Poly - where only the polymer disc without cell sowing was inserted; positive control where hDPSCs were inserted the same density of the previous groups and, negative controlwithout cells or biomaterial, to standardize the vascular pattern without interventions. On the 14th embryonic day, the openings in the barks were enlarged and standardized digital images were performed for macroscopic evaluation of vascularization. The MCAs of all eggs were removed for histological analysis by hematoxylin-eosin staining for microscopic evaluation of angiogenesis. Immunohistochemical staining for CD34 and Actin smooth muscle (AML) and immunofluorescence for Lamin-A antibodies were used to be representative of the presence of endothelial cells, blood vessels and hDPSCs, respectively. The results showed that there was an increase in the number of vessels and intersections and a histological correspondence of angiogenesis in the presence of the poly ?caprolactone/poly (rotaxane)/hDPSCs. It was also possible to observe that the undifferentiated cells seemed to stimulate angiogenesis more intensely when compared to the differentiated cells. The blend of poly ?-caprolactone/poly (rotaxane) have the potential to stimulate angiogenesis especially when functionalized by stem cells and shows a promising performance as bioactive biomaterial for bioengineering in regenerative therapies.
 
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Date de Publication
2021-10-01
 
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