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Doctoral Thesis
DOI
10.11606/T.23.2012.tde-13042013-103307
Document
Author
Full name
Fernanda Salgueiredo Giudice
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2012
Supervisor
Committee
Pinto Júnior, Décio dos Santos (President)
Abrahão, Aline Corrêa
Castilho, Rogério Moraes de
Coletta, Ricardo Della
Tucci, Renata
Title in Portuguese
O envolvimento da remodelação da cromatina no controle do comportamento agressivo dos carcinomas epidermoides de cabeça e pescoço
Keywords in Portuguese
BMI-1
Carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço
Células-tronco
Histona
Remodelação da cromatina
Transição epitélio-mesenquimal
Vimentina
Abstract in Portuguese
Modificações nas histonas são conhecidas por regular a estrutura conformacional da cromatina e a expressão gênica em células adultas e células-tronco pluripotentes. Tem sido postulado que a acetilação e deacetilação das histonas podem influenciar a expressão de genes envolvidos na iniciação, progressão e metástase tumoral, além de contribuir para o desenvolvimento de resistência à quimioterapia. Assim, buscou-se avaliar a influência das modificações nas histonas sobre a biologia do carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço (CECP) e sua respectiva subpopulação de células semelhantes às células-tronco (CSC). Inicialmente, foi checado os níveis de acetilação da histona H3 (membro das histonas nucleares associado à compactação da cromatina) em um painel representativo de linhagens celulares de CECP. Posteriormente, para estudar a influência do estroma tumoral no padrão de acetilação da histona H3, o microambiente do tumor foi mimetizado através da utilização de meio condicionado derivado do cultivo de fibroblastos e cultura primária de células endoteliais humanas. Além disso, validamos esses resultados in vitro por meio de amostras humanas de CECP. Finalmente, a acetilação e deacetilação da cromatina foi induzida, respectivamente, pela administração dos inibidores das enzimas histona deacetilase tricostatina A (TSA) e histona acetiltransferase curcumina, em linhagens celulares de CECP. Foi feita a análise da formação de esferas (ensaio funcional de células-tronco), juntamente com a verificação dos níveis de ALDH, marcador de células-tronco (citometria de fluxo - FACS), além da determinação do índice de proliferação tumoral (Ki-67) e realização dos ensaios de invasão e migração celular. Linhagens celulares de CECP apresentaram níveis baixos de acetilação da histona H3 e demonstraram capacidade de retenção de uma subpopulação de CSC. Apenas o meio condicionado de células endoteliais humanas foi capaz de alterar a conformação da cromatina, uma vez que induziu o aumento da acetilação da histona H3. Interessantemente, foi também notado um concomitante aumento da agressividade de linhagens celulares de CECP (aumento dos níveis de BMI-1 e vimentina). Esses resultados foram confirmados em amostras humanas de CECP que mostraram, apenas no fronte de invasão, células com cromatina acetilada. Curiosamente, essas mesmas células também expressaram vimentina. Os tratamentos com TSA e curcumina resultaram na diminuição significativa da subpopulação de CSC, interrompendo a formação de esferas e reduzindo os níveis de ALDH. Além disso, o tratamento com curcumina mostrou resultados muito interessantes, uma vez que gerou uma redução evidente da invasão celular e impactou por completo o potencial de migração tumoral, sendo nesse sentido mais eficiente que a cisplatina, droga antineoplásica bem estabelecida. Por outro lado, o tratamento com TSA induziu a transição epitélio-mesenquimal nas linhagens celulares de CECP, detectada pelo aumento da expressão de vimentina e indução de um fenótipo fusiforme, juntamente com o aumento da invasão tumoral e os níveis de BMI-1. Portanto, a organização da cromatina está envolvida na modulação da presença de CSC e os altos níveis de acetilação das histonas intensificam o comportamento agressivo de células de CECP.
Title in English
The involvement of chromatin remodeling in the control of head and neck squamous cell carcinoma behavior
Keywords in English
BMI-1
Chromatin remodeling
Epithelial to mesenchymal transition
Head and neck squamous cell carcinoma
Histone
Stem cells
Vimentin
Abstract in English
Histone modifications are known to regulate chromatin conformation structure and gene expression in adult cells and pluripotent stem cells. It has been postulated that histone acetylation and deacetylation could influence the expression of genes involved in cancer initiation, progression, metastasis, and development of resistance to chemotherapies. Here, we sought to evaluate the influence of histone modifications over the biology of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) and its stem cell-like subpopulation (CSC). Initially, we checked the status of histone H3 acetylation (a member of the core histones associated to chromatin compaction) in a representative set of HNSCC cell lines. Subsequently, to analyze the influence of tumor stroma over the histone H3 acetylation, we mimicked the tumor microenvironment by using conditioned medium from fibroblasts and primary human endothelial cells. Further we validated these in vitro findings through human samples of HNSCC. Finally, we induced chromatin acetylation and deacetylation by the administration of the histone deacetylase inhibitor trichostatin A (TSA) and histone acetyltransferase inhibitor curcumin, respectively, in HNSCC cell lines. The analysis of spheres formation (stem cell functional assay), along with the levels of stem cells marker ALDH (showed by flow cytometry - FACS), tumor proliferation index (Ki-67), invasion and migration cellular potencial were verified. HNSCC cell lines showed lower levels of histone H3 acetylation and ability to retain a subpopulation of CSC. Only conditioned media from human endothelial cells was able to alter the conformation of chromatin, since it induced the increase of histone H3 acetylation. Interestingly, it was also noted a concomitant augment of HNSCC cell lines aggressiveness (enhanced BMI-1 and vimentin levels). These findings were confirmed in human samples of HNSCC that showed, only at the invasive front, cells with acetylated chromatin. Curiously, these same cells also expressed vimentin. TSA and curcumin treatments resulted in significant decrease of the CSC subpopulation by disrupting the spheres and reducing the levels of ALDH. Also, curcumin treatment showed exciting results since it caused an evident reduction of cellular invasion and it impacted the tumoral migration potential, being more efficient than cisplantin, a well-established antineoplastic drug. However, TSA induced epithelial to mesenchymal transition in HNSCC cell lines detected by the upregulation of vimentin and the induction of a fusiform phenotype along with augmented tumor invasion and the levels of BMI-1. Chromatin organization is involved in the modulation of CSC where high levels of histone acetylation intensify the aggressive behavior of HNSCC cells.
 
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Publishing Date
2013-05-27
 
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