Tese de Doutorado

As células Natural Killer (NK) possuem papel central na resposta imune inata contra tumores. Na hematopoese, além de sua propriedade citotóxica, há evidências de que apresentam capacidade regulatória sobre as células-tronco hematopoéticas (CTH), reduzindo sua frequência e potencial de autorrenovação. Em neoplasias originadas de transformação neoplásica das CTH, esta regulação parece não ser eficiente. Considerando que as CTH normais podem responder aos estímulos mediados pelas células NK, é possível que deficiências funcionais contribuam para expansão de células-tronco neoplásicas e resistência à ação antileucêmica das células NK. Demonstramos previamente um comprometimento funcional de células NK no modelo murino Jak2V617F e células primárias de pacientes com neoplasias mieloproliferativas (NMPs), destacando-se o aumento da frequência de células NK imaturas e a redução da citotoxicidade da fração CD27^-CD11b⁺ mais madura. Não se sabe se as células iniciadoras de NMPs são intrinsecamente resistentes à imunidade tumoral ou se são capazes de modificar as células NK do microambiente leucêmico, tornando-as disfuncionais. Para investigar a contribuição do microambiente leucêmico no fenótipo disfuncional de células NK, geramos um modelo murino quimérico no qual células da medula óssea de animais C56BL/6 portadores ou não da mutação Jak2V617F (Jak2VF ou Jak2WT) foram injetadas em animais selvagens subletalmente irradiados, de modo a preservar parcialmente a hematopoese do receptor. A enxertia de 40-50% foi comprovada por citometria de fluxo após quatro e oito semanas. Observamos que a exposição ao microambiente leucêmico alterou a maturação funcional, levando a um predomínio de células NK secretórias maduras (CD27⁺CD11b⁺) e citotóxicas (CD27^-CD11b⁺). Além disso, foi observado aumento da expressão do receptor de ativação CD244 e diminuição do seu ligante CD48 no grupo de exposição à NMP. Funcionalmente, a exposição ao microambiente leucêmico induziu um aumento na morte celular específica dependente de células NK sem alterar a ativação ou degranulação, avaliadas pela frequência de CD107 e CD69, enquanto células NK derivadas da leucemia se mostraram deficientes. Dentre outras, observou-se aumento da expressão das citocinas IFNg e TNFa em células LSK do enxerto leucêmico. Sugerimos que a expressão de TNFa participe da resistência à apoptose de células tumorais e que o aumento de IFNg possa levar a um prejuízo na atividade citotóxica de células NK. Em conclusão, apesar do modelo semiablativo de transplante não levar ao fenótipo de NMP, a exposição ao microambiente leucêmico induziu alterações de frequência, maturação funcional e desbalanço de receptores NK. Tais efeitos são dependentes da carga de doença Jak2-mutada, de modo que a disfunção de ativação e degranulação das células NK foi observada apenas nas células do enxerto leucêmico. Esses achados destacam a importância das interações entre células imunes, microambiente tumoral e células-tronco leucêmicas, visando o desenvolvimento de estratégias terapêuticas que reforcem as vias de sinalização deficientes na proteção antitumoral das NMPs.

Natural Killer (NK) cells play a central role in the innate immune response against tumors. In hematopoiesis, beyond their cytotoxic properties, there is evidence that they have regulatory capacity over hematopoietic stem cells (HSCs), reducing their frequency and self-renewal potential. In neoplasms originating from the neoplastic transformation of HSCs, this regulation seems to be inefficient. Considering that normal HSCs can respond to stimuli mediated by NK cells, it is possible that functional deficiencies contribute to the expansion of neoplastic stem cells and resistance to the antileukemic action of NK cells. We previously demonstrated functional impairment of NK cells in the murine Jak2V617F model and primary cells from patients with myeloproliferative neoplasms (MPNs), highlighting the increase in the frequency of immature NK cells and the reduction in the cytotoxicity of the more mature CD27-CD11b+ fraction. It is not known whether MPN-initiating cells are intrinsically resistant to tumor immunity or if they are capable of modifying NK cells in the leukemic microenvironment, making them dysfunctional. To investigate the contribution of the leukemic microenvironment to the dysfunctional phenotype of NK cells, we generated a chimeric murine model in which bone marrow cells from C56BL/6 animals harboring or not the Jak2V617F mutation (Jak2VF or Jak2WT) were injected into sublethally irradiated wild-type animals, partially preserving the recipient's hematopoiesis. Engraftment of 40-50% was confirmed by flow cytometry after four and eight weeks. We observed that exposure to the leukemic microenvironment altered functional maturation, leading to a predominance of mature secretory NK cells (CD27+CD11b+) and cytotoxic NK cells (CD27-CD11b+). Additionally, there was an increase in the expression of the activation receptor CD244 and a decrease in its ligand CD48 in the NMP exposure group. Functionally, exposure to the leukemic microenvironment induced an increase in specific NK cell-dependent cell death without altering activation or degranulation, evaluated by the frequency of CD107 and CD69, while leukemia-derived NK cells were found to be deficient. Among others, there was an increase in the expression of IFNg and TNFa in LSK cells from the leukemic graft. We suggest that the expression of TNFa contributes to tumoral apoptosis resistance and that the increase in IFNg may impair the cytotoxic activity of NK cells. In conclusion, despite the semi-ablative transplant model not leading to an overt MPN, exposure to the leukemic microenvironment induced alterations in frequency, functional maturation, and NK receptor imbalance. These effects are dependent on the Jak2-mutated disease burden, as the dysfunction of NK cell activation and degranulation was only observed in cells from the leukemic graft. These findings highlight the importance of interactions between immune cells, the tumor microenvironment, and leukemic stem cells, aiming to develop therapeutic strategies that reinforce deficient signaling pathways in the antitumor protection of MPNs.