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Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/T.17.2021.tde-11062021-081432
Documento
Autor
Nome completo
Thiago Mantello Bianco
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2020
Orientador
Banca examinadora
Pontes, Lorena Lôbo de Figueiredo (Presidente)
Frantz, Fabiani Gai
Machado Neto, João Agostinho
Pinheiro, Ronald Feitosa
Título em português
Regulação das células-tronco hematopoéticas mediada pelas células Natural Killer em modelo de neoplasia mieloproliferativa
Palavras-chave em português
Células Natural Killer
Mutação JAK2
Neoplasias mieloproliferativas
Resumo em português
A mutação JAK2V617F é o principal defeito molecular observado em neoplasias mieloproliferativas (NMP) negativas para o rearranjo t(9;22)/BCR-ABL1, está presente em 95% dos pacientes com policitemia vera (PV) e é observada em aproximadamente 50% dos pacientes com trombocitemia essencial (TE) e mielofibrose primaria (MFP). Além das mutações, diferentes células do nicho da medula óssea podem contribuir para o início e manutenção da doença. As células Natural Killer (NK) são linfócitos que tem um papel central na resposta imune inata contra tumores. Além das suas propriedades anti-leucêmicas, essas células apresentam uma alta capacidade regulatória que as tornam capazes de reduzir o potencial de enxertia e auto renovação de células-tronco hematopoiéticas (CTH) normais. Entretanto, em neoplasias originadas de transformação neoplásica das CTH, não se sabe até o momento se esta regulação é eficiente. Considerando que as CTH normais podem responder a estímulos mediados pelas células NK, é possível que uma deficiência funcional das células NK contribua para expansão de células-tronco neoplásicas ou que as CTH transformadas se tornem resistentes à ação antileucêmicas das células NK. Para estudar tal hipótese, utilizamos um modelo murino condicional knockin de expressão heterozigótica da mutação Jak2V617F (Jak2VF), no qual os camundongos que expressam a mutação desenvolvem uma neoplasia mieloproliferativa letal que se assemelha à PV humana. Realizamos análises imunofenotípicas e funcionais das células NK dos camundongos Jak2WT e Jak2VF isoladamente e em co-cultivo com CTH, avaliando seu potencial de proliferação, diferenciação e auto renovação. Os resultados mostraram que o baço dos animais doentes apresentava células NK CD27+ e uma redução de células NK CD11b+. Embora não significativo, quando comparados aos animais saudáveis, houve uma tendência ao acumulo de células NK CD27-CD11b- nos camundongos JAK2VF, o que corrobora com o aumento de células imaturas no baço. Além disso, observou-se que o perfil fenotípico das células NK na medula óssea é diferente da população de células NK do baço, na qual, os grupos JAK2WT e JAK2VF apresentou um acumulo de células imaturas e secretórias. Os ensaios funcionais revelaram que, quando comparadas ao grupo controle, as células NK no grupo JAK2VF apresentaram menor capacidade proliferativa e reduziram a frequência de células CD69+ após estimulo com PMA e ionomicina. Além disso, os dados demonstraram que a proporção de células NK CD69+CD107a+ foi similar em ambos os grupos. Os estudos da interação de células NK com CTH por meio do ensaio de CFU, revelou que o contato prévio com células NK isoladas dos animais saudáveis foi capaz de reduzir o potencial clonogênico de CTH, no entanto, o mesmo não foi observado com as CTH foram expostas a interação com células NK JAK2VF. Em resumo, os resultados obtidos neste estudo permitiram caracterizar um perfil imaturo e secretório de células NK JAK2VF. Funcionalmente, os dados revelaram que essas células apresentam menor capacidade de ativação, proliferação e de inibição do potencial clonogênico CTH. O comportamento fenotípico e funcional aberrante das células NK JAK2VF sugere um comprometimento da imunovigilancia do câncer e pode associar-se com a sustentação da doença. Além disso os dados apresentados forneceram uma nova perspectiva sobre comportamento das células NK no contexto de neoplasias mieloides. Acreditamos que a compreensão da heterogeneidade fenotípica e funcional dessas células possa contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas direcionadas ao controle das funções das CTH transformadas.
Título em inglês
Hematopoietic stem cells regulation mediated by natural killer cells in a myeloproliferative neoplasm model
Palavras-chave em inglês
Jak2 mutation
Myeloproliferative neoplasms
Natural Killer Cells
Resumo em inglês
JAK2V617F mutation is the most common molecular abnormality observed in t(9;22)/BCR-ABL1- -negative myeloproliferative neoplasms (MPN). It is present in 95% of patients with Polycythemia Vera (PV) and observed in approximately 50% of patients with Essential Thrombocythemia (ET) and Primary Myelofibrosis (PMF). In addition to driver mutations that activate the JAK/STAT signaling pathway, different cells from the bone marrow niche may contribute to the initiation and maintenance of the disease. Natural Killer (NK) cells are a subset of lymphocytes that play a central role in the innate immune response to tumors. Besides their anti-leukemic properties, these cells have a high regulatory capacity that makes them capable of reducing hematopoietic stem cells (HSCs) potencial of engraftment and self-renewal. However, it is currently unknown if this NK regulation also occurs in the context of neoplastic transformation. Considering that normal HSCs may respond to NK cell-mediated stimuli, it is possible that NK regulation may favor the malignant transformation of HSCs or that neoplastic HSCs are resistant to the its anti-leukemic actions. To address this hypothesis, we used a conditional knockin Jak2V617F mutation (Jak2VF) murine model, which faithfully resembles the main clinical and laboratorial characteristics of human PV. We performed phenotypical and functional analyses of NK cells. Furthermore, co-cultures of Jak2WT and Jak2VFisolated NK cells with wild-type HSCs were used to assess their potential for proliferation, differentiation and self-renewal after NK exposure. In this study, we showed that the frequency of phenotypic profile of NK cells in the spleen of mice that harbor JAK2VF mutation increased CD27+NK cells and reduce the NK CD11b+ cells profile. Although we did not reach a statistical significance, when compared to healthy mice, there was a tendency to accumulate NK CD27-CD11b- cells in JAK2VF mice, which corroborates the increase in immature cells in the spleen. In addition, the bone marrow-derivate NK cells presented a similar phenotype of NK cells from the spleen of JAK2VF mice. Functional assays showed that, when compared to the control group, NK cells in the JAK2VF group presented reduction of their proliferative capacity and decrased the frequency of CD69+ cells after stimulation with PMA and ionomycin. Furthemore, the data demonstrated in both group a similar proportion of CD69+CD107a+NK cells after stimulation with PMA plus ionomycin. The evaluation of interaction between NK cells and HSC through the CFU assay revealed that previous contact with NK cells isolated from healthy animals was able to reduce the clonogenic potential of HSC, however, the same was not observed with HSCs exposed to interaction with NK JAK2VF cells. In summary, the results obtained in this study allowed to characterize an immature and secretory profile of NK JAK2VF cells. Functionally, the data revealed that these cells have less capacity for activation, proliferation and inhibition of HSC clonogenic potential. The arrest of immature profile and defects of functional NK JAK2VF cells suggests an impairment of cancer immunovigilance. Furthermore, the data provided a new perspective on the behavior of NK cells in the context of myeloid malignances. We believe that understanding the phenotypic and functional heterogeneity of these cells can contribute to the development of new therapeutic strategies aimed at controlling the functions of transformed HSCs. Therefore, identifying the mechanisms of NK-cell deficiency in myeloid neoplasms and the detailed interaction between these cells and the malignant stem cell may help to establish combination therapeutic strategies that may improve therapy responses.
 
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Data de Publicação
2021-06-18
 
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