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Dissertação de Mestrado
DOI
https://doi.org/10.11606/D.17.2015.tde-21012021-110311
Documento
Autor
Nome completo
Liziane Raquel Beckenkamp
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2015
Orientador
Banca examinadora
Covas, Dimas Tadeu (Presidente)
Câmara, Niels Olsen Saraiva
Rodrigues, Rodrigo do Tocantins Calado de Saloma
Título em português
Caracterização de células estromais mesenquimais do tecido adiposo selecionadas a partir da expressão diferencial do marcador de superfície celular CD271
Palavras-chave em português
CD271
Células estromais mesenquimais multipotentes
Células-tronco
Sorting celular
Tecido adiposo
Resumo em português
Células estromais mesenquimais multipotentes (CTMs) são um tipo de células-tronco/progenitoras pós-natal de grande interesse na comunidade científica, principalmente por sua habilidade de secretar inúmeras moléculas com propriedades antiapoptóticas, imunorregulatórias e angiogênicas que podem trazer benefícios para a aplicação das mesmas na medicina regenerativa. No entanto, a grande heterogeneidade desta população de células aliada à falta de um marcador específico para identificá-las, têm dificultado a compreensão da sua biologia e uma melhor utilização destas células na clínica. Diferentes epítopos de superfície celular têm sido propostos como potenciais marcadores para CTMs, mas se estes podem ser utilizados para identificar todos os tipos de CTMs, independente de sua fonte primária, ainda não esta totalmente elucidado. Por este motivo, este trabalho investigou a capacidade do marcador de superfície celular CD271, comumente associado à CTMs da medula óssea (CTMs-MO), em enriquecer CTMs obtidas do tecido adiposo (CTMs-TA). Para tanto, células da fração estromal vascular (FEV) do tecido adiposo humano foram selecionadas por sorting celular com base na expressão do CD271 (CD45-CD31-CD34+CD271+ e CD45-CD31-CD34+CD271-) e avaliadas in vitro para verificar se apresentavam características de CTMs. Ambas as frações celulares obtidas por sorting e a FEV apresentaram capacidade clonogênica, morfologia fibroblastóide, potencial de diferenciação nas linhagens mesodérmicas e perfil imunofenotípico compatível com CTMs (CD90+, CD73+, CD31- e CD45-). Ao avaliar a capacidade de duplicação populacional entre as frações celulares de interesse não se observaram diferenças no potencial proliferativo entre elas, no entanto, ambas as células CD271+ e CD271- foram mais proliferativas que a FEV. Além disso, os ensaios de formação de colônias fibroblastóides (CFU-Fs) revelaram que células CD271- geravam em média o dobro de colônias em relação à FEV e células CD271+. Quando comparado o potencial de diferenciação nas linhagens mesodérmicas, os resultados de diferenciação osteogênica demonstraram que o antígeno CD271 pode estar relacionado com vias de sinalização que aumentam a capacidade de mineralização das CTMs, visto que as células CD271+ produziram significativamente mais matriz mineralizada que as células CD271- e FEV. Em adição, ao comparar o fenótipo das frações celulares (CD271+ e CD271-) sem cultivo celular com marcadores associados à pericitos por expressão gênica e/ou western blotting observou-se que existem algumas diferenças entre estas células, sendo que células CD271+ apresentam algumas similaridades com pericitos. Apesar de ambas as frações celulares apresentarem transcritos do gene CD140b, apenas a fração CD271+ apresentou a proteína pelas análises de western blotting. De maneira semelhante, o gene NESTINA também se mostrou mais expresso em células CD271+ quando comparado as células CD271-. Investigando-se a localização in situ destes marcadores por imunofluorescência no tecido adiposo, as fotomicrografias obtidas por microscopia confocal sugerem que células CD34+ estejam localizadas na túnica adventícia de grandes vasos enquanto que células CD271+ parecem estar situadas justapostas ao endotélio. Em conclusão, embora a fração celular CD271+ seja enriquecida com CTMs na medula óssea, nossos resultados demonstram que, no tecido adiposo, células com características de CTMs in vitro estão distribuídas entre ambas as populações celulares CD271+ e CD271-, o que demonstra que a origem do tecido pode alterar o fenótipo das CTMs. Além disso, demonstramos que existem algumas diferenças fenotípicas entre as células CD34+CD271+ e CD34+CD271- que poderão auxiliar na elucidação da identidade e localização in vivo das CTMs no tecido adiposo.
Título em inglês
Characterization of mesenchymal stromal cells from adipose tissue selected by differential expression of molecular marker CD271
Palavras-chave em inglês
Adipose tissue
CD271
Cell sorting
Multipotential mesenchymal stromal cells
Stem cells
Resumo em inglês
Multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) are subject of great interest in the scientific community, mainly for their potential to secrete several molecules with anti-apoptotic, immunoregulatory and angiogenic properties that might be benefic for regenerative medicine. However, the great heterogeneity of these cells together with the lack of a specific marker to define the MSCs has impaired the compress your biology and better clinical application. The large number of different markers has been associated with MSCs, but if they can be employed to all types of the MSCs, regardless of their primary source, remains unknown. To test this hypothesis, this study evaluated if the bone marrow MSCs'marker CD271 is also effective on enriching adipose-derived MSCs (ATSCs). Freshly isolated cells from the stromal-vascular fraction (SVF) from human adipose tissue were sorted based on CD271 (CD45-CD31-CD34+CD271+ and CD45-CD31-CD34+CD271-) and assays in vitro were conducted to verify whether these cells are endowed with MSCs'characteristics. Both cell populations and SVF displayed clonogenic capacity, fibroblastic morphology, multipotential differentiation and immunophenotype from MSCs (CD90+, CD73+, CD31- e CD45-). When evaluated the proliferation potential among cells fractions there isn't differences in population doubling, however, both CD271+ and CD271- cells were more proliferative than SVF. Furthermore, CD271- ATSCs are 2-fold enrichment of fibroblastic colonies (CFU-Fs) compared to SVF and cells CD271+. When compared the differentiation capacity into mesodermal lineages, the data of osteogenic differentiation suggest that the antigen CD271 might be involved with signaling pathways that increase mineralization capacity from MSCs, whereas CD271+ cells produced more mineralized matrix than CD271- cells and SVF. In addition, when compared the imunophenotypic of freshly isolated cells fractions (CD271+ and CD271-) with markers associates to pericytes by gene expression and western blotting, the analyses reveals that there are some differences among CD271+ and CD271- cells, which the first showed some similarities with pericytes. Even though both cell fractions revealed transcripts of the gene CD140b, only CD271+ fraction exhibited the protein in western blotting. Likewise, the gene NESTINA was more expressed in CD271+ cells than CD271- cells. Indeed, the immunoflourescence staining in situ suggest that CD34+ cells are localized in tunica adventitia from large blood vessels and CD271+ cells are situated near the endothelium. Taken together, the results reveals that although the CD271+ cell fraction is enriched with MSCs in bone marrow, in adipose tissue cells with MSCs' traits are distributed between CD271+ and CD271- cells. Furthermore, we suggest that there is a difference among these fractions (CD271+ and CD271-) that may help on the elucidation of MSCs'native identity and your localization in vivo on adipose tissue.
 
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Data de Publicação
2021-01-26
 
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