A hemofilia A (HA) é uma doença hemorrágica causada por mutações que levam à deficiência na produção ou função do fator VIII da coagulação (FVIII). O desafio atual é estabelecer uma terapia profilática e duradoura capaz de assegurar níveis plasmáticos de FVIII suficientes para corrigir o fenótipo da HA. Uma das estratégias é modificar células ex vivo para expressar o FVIII e transplantá-las para que secretem a referida proteína in vivo. No entanto, esta abordagem tem sido limitada pela sobrevida curta das células transplantadas. Neste trabalho, hipotetizamos que células endoteliais vasculares da veia do cordão umbilical (HUVECs) e células progenitoras perivasculares como as células estromais do tecido adiposo (ADSCs) poderiam ser co-transplantadas para formar organoides vascularizados que serviriam como veículos produtores de FVIII in vivo. Para isso, primeiramente investigamos o potencial do meio para crescimento de células endoteliais (EGM-2) contendo fatores de crescimento pró-angiogênicos na manutenção das propriedades progenitoras e pró-angiogênicas das ADSCs após cultivo. Para tanto, primeiramente comparamos o efeito de formulações de meios convencionais (DMEM + 10% de soro fetal bovino [DMEM] e αMEM + 15% de SFB [αMEM]) e do EGM-2 na eficiência clonogênica, proliferação e diferenciação in vitro das ADSCs. ADSCs cultivadas em EGM-2 (ADSC-EGM) apresentaram a maior eficiência clonogênica, maior potencial proliferativo e maior capacidade de diferenciação adipogênica e osteogênica, seguidas pelas ADSC-αMEM e pelas ADSC-DMEM, respectivamente. Em seguida, investigamos o potencial das ADSC-EGM e ADSC-αMEM em dar suporte à sobrevida das HUVECs e de estimular a angiogênese. Para isso, modificamos HUVECs para expressar a proteína repórter bioluminescente luciferase 2 e utilizamos o sinal bioluminescente para monitorar a sobrevida das mesmas. Após co-cultivo em meio reduzido de fatores de crescimento, apenas as ADSC-EGM atenuaram a apoptose das HUVECluc, sendo que a sobrevida das HUVECluc foi diretamente proporcional à quantidade de ADSC-EGM nos co-cultivos. Além disso, apenas as ADSC-EGM estimularam a formação de cordões endoteliais pelas HUVECluc durante o co-cultivo sob privação de fatores de crescimento. Notadamente, a extensão e ramificação da rede de cordões endoteliais formada foi diretamente proporcional à quantidade de ADSC-EGM. Estes efeitos anti-apoptótico e pró-angiogênico das ADSC-EGM foram recapitulados quando utilizamos apenas o meio condicionado das ADSC-EGM, indicando que o secretoma das ADSCs é alterado após cultivo em EGM-2. Em seguida, ADSCs e HUVECluc foram co-transplantadas subcutaneamente em camundongos imunodeficientes e a sobrevida das HUVECluc foi avaliada pela quantificação da bioluminescência. Após 60 dias, a quantidade de HUVECluc vivas foi equivalente entre aquelas transplantadas sozinhas ou com ADSC-αMEM (15,0%±0,7% vs 13,0%±0,5%, respectivamente). Entretanto, a sobrevida das HUVECluc co-transplantadas com ADSCEGM atingiu 105%±3,5%. Análises histológicas demonstraram que os organoides gerados pela co-infusão de HUVECluc e ADSC-EGM apresentaram maior densidade vascular e os vasos sanguíneos eram funcionais, a julgar pela presença de eritrócitos em seus lúmens. Em seguida, as ADSC-EGM e HUVECs foram modificadas para expressar o FVIII humano com o domínio B parcialmente deletado e transplantadas subcutaneamente em camundongos hemofílicos A imunodeficientes, os quais foram gerados após o cruzamento de machos NSG com fêmeas hemofílicas. Em todas as tentativas de transplante não houve aumento na atividade biológica do FVIII no plasma dos animais. Para avaliar se a rota de infusão estava influenciando a distribuição do FVIII na circulação, transplantamos células de adenocarcinoma hepático SK-HEP expressando FVIII e luciferase pelas vias subcutânea e intra-hepática. Após 8 dias, apenas os animais que receberam o transplante intra-hepático apresentaram uma atividade biológica do FVIII no plasma superior a 0,5 UI/mL. Após 15 dias, a atividade detectada foi pelo menos de 1 UI/mL, ao passo que os animais transplantados subcutaneamente não apresentavam níveis detectáveis de FVIII no plasma. Utilizando dados de bioluminescência, observamos que as células transplantadas subcutaneamente ou no fígado apresentavam a mesma velocidade de crescimento. Em suma, nosso dados demonstram que o cultivo das ADSCs em um microambiente pró-angiogênico aumenta sua eficiência clonogênica, sua capacidade de diferenciação in vitro e seu potencial em promover a sobrevida de células endoteliais e estimular a angiogênese in vivo em comparação com estratégias de cultivo convencionais. Estas observações abrem caminho para a identificação de moléculas importantes na regulação da multipotência e da atividade pró-angiogênica das ADSCs. Além disso, nossos achados estabelecem uma estratégia capaz de aumentar a eficiência terapêutica das ADSCs contra doenças isquêmicas e de elevar a sobrevida de células endoteliais co-transplantadas para servir como veículo produtor de proteínas terapêuticas in vivo. Por fim, concluímos que o local de implante das células expressando FVIII é crítico para a eficiência terapêutica deste tipo de terapia celular para a correção da HA.

Hemophilia A (HA) is a hemorrhagic disorder caused by a deffective production or function of the coagulation factor VIII (FVIII). One of the frontiers in HA treatment is to establish a long-lasting prophylactic therapy to provide sufficient plasma levels of FVIII to correct the bleeding phenotype. One of the strategies to accomplish this is to modify cells ex vivo to express FVIII and transplant them to secrete the therapeutic protein in vivo. However, this approach has been limited by the poor survival of the transplanted cells. In this work, we hypothesized that the human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and perivascular progenitor cells such as the adipose-derived stromal cells (ADSCs) could be co-transplanted to form vascularized organoids which could serve as vehicles for FVIII production in vivo. For this, we innitially investigated the potential of endothelial cell growth medium (EGM-2) containing pro-angiogenic growth factors on the maintenance of progenitor and pro-angiogenic properties of ADSCs after culture. To this end, we first compared the effect of conventional media formulations (DMEM + 10% fetal bovine serum [DMEM], and αMEM + 15% FBS [αMEM]) and EGM-2 on the clonogenic efficiency, proliferation and in vitro differentiation of ADSCs. ADSCs cultured in EGM-2 (ADSC-EGM) presented the highest clonogenic efficiency, proliferative potential and adipogenic and osteogenic differentiation abilities, followed by the ADSCs cultured in αMEM (ADSC-αMEM) and in DMEM (ADSC-DMEM), respectively. Next, we investigated the potential of ADSC-EGM and ADSC-αMEM to support the survival of HUVECs and to promote angiogenesis. For this purpose, HUVECs were modified to express the bioluminescent enzime luciferase 2 and the bioluminescent signal was used to monitor cell survival. After co-culture in a growth factor reduced medium (i.e. αMEM+1% FBS), only the ADSC-EGM attenuated HUVECluc apoptosis, and the survival of HUVECluc was directly proportional to the amount of ADSC-EGM seeded. Furthermore, only the ADSCEGM were able to stimulate the formation of endothelial cords by HUVECluc during coculture under growth factor starvation. Notably, the length and branching of the endothelial cords were directly proportional to the amount of ADSC-EGM in the cocultures. These anti-apoptotic and pro-angiogenic effects of ADSC-EGM were recapitulated by the ADSC-EGM conditioned medium, indicating that the secretome of the ADSCs is altered upon culture in EGM-2. Next, HUVECluc and ADSCs were cotransplanted subcutaneously into immunodeficient mice and the survival of HUVECluc was monitored by bioluminescent imaging. After 60 days the amount of living HUVECluc was equivalent between those transplanted with HUVECluc alone and those co-transplanted with HUVECluc and ADSC-αMEM (15.0%±0.7% vs. 13.0%±0.5%, respectively). However, the survival of HUVECluc co-transplanted with ADSC-EGM reached 105.0%±3.5%. Histological analysis showed that the organoids generated by the co-transplanation of HUVECluc and ADSC-EGM had the higher vascular density and that the blood vessels formed were functional, as indicated by the presence of erythrocytes within their lumens. Next, the ADSC-EGM and HUVECs were engineered to express human FVIII with the Bdomain partially deleted and were transplanted subcutaneously in immunodeficient hemophilic A mice, which were generated after crossing NSG males with hemophilic A females. All attempts of transplantation did not resulted in any increase of the biological activity of FVIII in the plasma of the animals. To evaluate whether the site of transplantation was influencing the distribution of FVIII to the circulation, we transplanted liver adenocarcinoma SK-HEP cells expressing both FVIII and luciferase 2 by subcutaneous and intrahepatic injections. After 8 days, the animals receiving the intrahepatic injections displayed plasma levels of FVIII above 0.5 IU/mL. After 15 days, the FVIII levels increased to at least 1.0 IU/mL. In a sharp contrast, animals that received subcutaneous injections showed no increase in the plasmatic levels of FVIII. Using bioluminescence quantification, we observed that the cells transplanted subcutaneously or intrahepatically showed similar growth rates in vivo. Collectively, these findings demonstrate that the cultivation of the ADSCs in a pro-angiogenic millieu increases their clonogenic efficiency, in vitro differentiation capacity and their potential to promote survival of endothelial cells and stimulate angiogenesis in vivo. These findings lay the groundwork for identifying key modulators of ADSCs multipotency and proangiogenic properties. Moreover, our pre-conditioning strategy may be explored as a strategy to increase the therapeutic efficiency of ADSCs against ischemic diseases and to increase the survival of co-transplanted endothelial cells to serve as a vehicle for delivering therapeutic proteins in vivo. Finally, we conclude that the implantation site of FVIII-expressing cells is crucial to achieve the correction of HA.