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Dissertação de Mestrado
DOI
https://doi.org/10.11606/D.17.2019.tde-19012021-120625
Documento
Autor
Nome completo
Alexander Rodrigo Ferreira
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2019
Orientador
Banca examinadora
Covas, Dimas Tadeu (Presidente)
Costa, Everton de Brito Oliveira
Pinto, Ana Cristina Silva
Título em português
O switching de globinas na diferenciação hematopoética in vitro
Palavras-chave em português
Globina
Hematopoese
iPSC
Proteômica dirigida
Switching
Resumo em português
Muitos modelos buscam reproduzir in vitro a eritropoese normal e ineficiente. Um dos maiores desafios está no desenvolvimento de células eritroides semelhantes às do indivíduo adulto e com funcionalidade preservada. A eficácia dessa diferenciação pode ser acompanhada com a avaliação das mudanças morfológicas, imunofenotípicas e da expressão gênica e de proteínas. As hemoglobinas são tetrâmetros de cadeias de globinas diretamente relacionadas à atividade funcional da célula eritroide madura, sendo importantes biomarcadores da diferenciação eritroide terminal. Ao longo do desenvolvimento humano, diferentes globinas são expressas com diferentes afinidades ao oxigênio. Inicialmente, há predomínio da expressão de globinas embrionárias, que são substituídas pelas fetais e posteriormente pelas adultas. Esse processo é denominado switching de globinas e sua regulação ainda não é totalmente compreendida. O presente estudo propôs a geração e caracterização da diferenciação de progenitores hematopoético/eritroides in vitro a partir de células-tronco de pluripotência induzida (iPSC), da linhagem K562 e de progenitores CD34+. e a avaliação de seu switching de globinas. Esse processo foi monitorado por análises morfológicas, imunofenotípica e de expressão gênica. A diferenciação das iPSC foi realizada com protocolo de formação de corpos embrioides e resultou em diminuição da frequência de marcadores de pluripotência e aumento de CD34+, CD36+, CD71+ e CD235a+ e expressão gênica de globinas, no entanto não foram capazes de formar colônias em ensaio de metilcelulose. Na diferenciação da linhagem K562 verificou-se o aumento da porcentagem de células Band 3 positivas e o aumento da expressão gênica da globina epsilon. A diferenciação dos progenitores CD34+ mostrou-se eficiente na geração de células eritroides terminalmente diferenciadas, mimetizando os estágios da eritropoese. Houve aumento da frequência de CD36+, CD235a+ e Band 3+. Houve mudança na expressão gênica de globinas e de reguladores do switching, sendo um importante modelo para o estudo dessa regulação. Além disso, foi desenvolvido um método de proteômica dirigida para o monitoramento do perfil de expressão de globinas que pode ser utilizado em protocolos de diferenciação eritroide in vitro.
Título em inglês
The globin switching of the in vitro hematopoietic differentiation
Palavras-chave em inglês
Globin
Hematopoiesis
iPSC
Switching
Targeted proteomics
Resumo em inglês
There are several models seeking to reproduce normal and inefficient erythropoiesis in vitro. One of the biggest challenges lies in the development of adult-like erythroid cells with functional activity. The effectiveness of this differentiation can be monitored by the evaluation of morphological, immunophenotypic and gene and protein expression changes. Hemoglobins are globin chain tetramers directly related to the functional activity of the mature erythroid cell, functioning as important biomarkers of terminal erythroid differentiation. Throughout human development, different globins are expressed with distinct oxygen affinities. Initially, there is an expression predominance of embryonic globins, which are replaced by fetal and later by adults. This process is called globin switching and its regulation is not fully understood. The present study proposed to generate and characterize the in vitro hematopoietic / erythroid progenitors' differentiation from induced pluripotency stem cells (iPSC), K562 lineage and CD34+ progenitors and evaluate their globin switching. This process was monitored by morphological, immunophenotypic and gene expression analyzes. The differentiation of iPSC was performed using the embryoid body formation protocol and resulted in decreased expression of pluripotency markers and increase of CD34+, CD36+, CD71+, and CD235a+ and globins gene expression, however they were not able to form colonies in the methylcellulose assay. There was an increase in the of Band 3 positive cells frequency and an increment in epsilon globin gene expression during the K562 strain differentiation. The differentiation of CD34+ progenitors was efficient in generating terminally differentiated erythroid cells, mimicking the erythropoiesis stages. An increased CD36+, CD235a+, and Band 3+ expression was observed. There was an important change in the globins gene expression and on the switching regulators, being an important model for the study of this regulation process. In addition, a targeted proteomics method was developed for monitoring the globins expression profile that can be applied in in vitro erythroid differentiation protocols.
 
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Data de Publicação
2021-01-27
 
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