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Mémoire de Maîtrise
DOI
https://doi.org/10.11606/D.17.2020.tde-05102020-093149
Document
Auteur
Nom complet
Antonio Bruno Alves da Silva
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
Ribeirão Preto, 2020
Directeur
Jury
Traina, Fabíola (Président)
Carvalheira, José Barreto Campello
Chahud, Fernando
Titre en portugais
Investigação dos efeitos da fenformina em neoplasias mieloproliferativas
Mots-clés en portugais
Biguanidas
Fenformina
JAK2V617F
Modelo murino
Policitemia vera
Resumé en portugais
Neoplasias mieloproliferativas (NMP) BCR-ABL1 negativas são caracterizadas por alterações moleculares que ocorrem a nível de célula-tronco e que desencadeiam proliferação excessiva das células da linhagem mieloide. As NMP BCR-ABL1 negativas clássicas são pela policitemia vera (PV), trombocitemia essencial (TE) e mielofibrose primária (MFP), que compartilham a ativação da via JAK/STAT, na maioria das vezes decorrente da presença da mutação JAK2V617F. As biguanidas, representada pela metformina e fenformina, são compostos extraídos de Galega officinalis que apresentam atividade hipoglicemiante para tratar pacientes com diabetes mellitus do tipo 2 (DM-2). Metformina inibe STAT3/5 e reduz o volume do baço em modelo murino e celular JAK2 V617F. A fenformina é mais potente que a metformina. Testamos a hipótese que a fenformina poderia inibir o fenótipo de NMP em modelos JAK2V617F. O objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade antineoplásica da fenformina em modelos de NMP JAK2V617F. Linhagem celular SET-2, modelo murino de NMP JAK2V617F e células primárias de pacientes com NMP foram utilizados. Viabilidade celular foi avaliada por ensaio de MTT e apoptose por Anexina-V-7AAD. O modelo murino de NMP JAK2V617F foi induzido pelo transplante de células provenientes da medula óssea total de camundongos JAK2 WT/Fl- -Vav/Cre CD45.2 em camundongos PepBoy C57BL/6 CD45.1, animais foram tratados com fenformina (40mg/kg/dia, intraperitoneal) ou veículo (PBS; 100μL/dia, intraperitoneal) por 7 semanas e avaliados quanto aos parâmetros hematimétricos, tamanho e peso do baço, histologia do baço e da medula óssea, clonogenicidade e frequência de células-tronco. A avaliação da capacidade de autorrenovação da célula-tronco foi avaliada pelo transplante de células da medula óssea de animais JAK2 WT/Fl- -Vav/Cre CD45.2 tratadas ex vivo com fenformina, metformina ou veículo e transplantadas em animais receptores Pepboy C57BL/6 CD45.1 irradiados com dose subletal. Células primárias de um paciente com MF foi tratada in vitro com fenformina ou veículo e submetida a ensaio de clonogenicidade. Para todas as análises estatísticas foi adotado nível de significância menor que 5%, os testes Mann-Whitney, One-Way ANOVA ou Two-Way ANOVA foram realizados conforme apropriado. A fenformina 5mM induziu apoptose celular em 49%, 67% e 75% da população de células avaliadas após 24, 48 e 72 horas de exposição, respectivamente. Modelo murino JAK2 V617F tratados com fenformina (n=7) ou veículo (n=7) apresentaram resultados similares quanto às alterações hematológicas; tamanho e peso do baço. A arquitetura da medula óssea e do baço não diferiu entre os dois grupos. O ensaio de clonogenicidade demonstrou resultado similar entre os dois grupos. A análise da frequência das células-tronco hematopoéticas (CTH) revelou aumento da população de progenitores mieloide (MP) (1.505 vs. 2.159, p=0.0070), progenitores multipotentes (0.1265 vs. 0.2479, p=0.006) (MPP) e LSK (0.2608 vs. 0.3816, p=0.0023) na medula óssea do grupo de animais tratados com fenformina. Não houve diferença entre ambos os grupos quanto aos precursores eritroides no baço e na medula óssea. Transplante de medula óssea com células JAK2V617F submetidas a tratamento ex vivo com fenformina (1mM, n=6), metformina (10mM, n=6) ou veículo (PBS, n=6) resultou em enxertia e parâmetros hematimétricos semelhantes em todos os grupos, após de 16 semanas de acompanhamento (p>0,05). A fenformina (1mM ou 2M) in vitro aboliu a formação de colônias em células primárias de paciente com MFP. Em conclusão, a fenformina in vitro apresentou efeito antineoplásico em modelos celulares JAK2V617F, mas não apresentou efeitos antineoplásicos em modelos in vivo e ex vivo de NMP JAK2 V617F.
Titre en anglais
Investigation of the effects of phenformin in myeloproliferative neoplasm
Mots-clés en anglais
Biguanides
JAK2V617F
Murine model
Phenformin
Polycythemia vera
Resumé en anglais
BCR-ABL1 negative myeloproliferative neoplasms (MPN) are characterized by molecular changes that occur at the stem cell level and that trigger excessive proliferation of cells of the myeloid lineage. Classic MPN BCR-ABL1 negative are polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (ET) and primary myelofibrosis (PMF), which share the activation of the JAK/STAT pathway, most often due to the presence of the JAK2V617F mutation. Biguanides, represented by metformin and phenformin, are compounds extracted from Galega officinalis that have hypoglycemic activity to treat patients with type 2 diabetes mellitus (DM-2). Metformin inhibits STAT3/5 and reduces the spleen volume in a murine and cellular JAK2 V617F model. Phenformin is more potent than metformin. We tested the hypothesis that phenformin could inhibit the MPN phenotype in JAK2V617F models. The aim of this work was to evaluate the antineoplastic capacity of phenformin in MPN JAK2V617F models. The SET-2 cell line, murine model of MPN JAK2V617F , and primary cells from PMF patient were used. Cell viability was assessed by MTT assay, and apoptosis by Anexina-V- 7AAD. The murine model of MPN JAK2V617F was induced by transplanting 5x106 whole bone marrow cells from JAK2WT/Fl- -Vav/Cre CD45.2 mice into PepBoy C57BL/6 CD45.1 mice. Animals were treated with phenformin (40mg/kg/day, intraperitoneal) or control (PBS; 100μL/day, intraperitoneal) for 7 weeks and evaluated for hematimetric parameters, spleen size and weight, spleen and bone marrow histology, clonogenicity, and stem cells frequency. The evaluation of the stem cells self-renewal capacity was assessed by transplanting bone marrow cells from JAK2 WT/Fl- -Vav/Cre CD45.2 animals treated ex vivo with phenformin, metformin or control and transplanted into recipient Pepboy C57BL/6 CD45.1 subletally irradiated. Primary cells from PMF patient were treated in vitro with phenformin or control and subjected to a clonogenicity assay. For all statistical analyzes, a significance level of less than 5% was adopted, the Mann-Whitney, One-Way ANOVA or Two-Way ANOVA tests were performed as appropriate. 5mM phenformin induced cell apoptosis in 49%, 67% and 75% of the cell population evaluated after 24, 48 and 72 hours of exposure, respectively. Murine JAK2V617F model treated with phenformin (n=7) or control (n=7) showed no difference in hematological changes, spleen size and weight. The bone marrow and spleen architecture did not differ between the two groups. The clonogenicity assay demonstrated no difference in the number of colonies between the two groups. The analysis of the frequency of hematopoietic stem cells (HSC) revealed an increase in the population of myeloid progenitors (MP) (1,505 vs. 2,159, p=0.0070), multipotent progenitors (0.1265 vs. 0.2479, p=0.006) (MPP) and LSK (0.2608 vs. 0.3816, p=0.0023) in the bone marrow of the group of animals treated with phenformin. There was no difference between both groups in terms of erythroid precursors in the spleen and bone marrow. Bone marrow transplantation with JAK2V617F cells submitted to ex vivo treatment with phenformin (1mM, n = 6), metformin (10mM, n = 6) or vehicle (PBS, n = 6) resulted in grafting and similar hematimetric parameters in all groups after 16 weeks of follow-up (p> 0.05). Phenformin (1mM or 2Mm) in vitro abolished colony formation in PMF primary cells. In conclusion, phenformin in vitro showed antineoplastic effect in JAK2V617F cell models, but did not show antineoplastic effects in vivo and ex vivo models of MPN JAK2V617F.
 
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Date de Publication
2020-10-26
 
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