Na terapia celular, o uso de células estromais mesenquimais (MSC) se dá pela sua propriedade imunomoduladora. Neste processo, a atividade parácrina das MSC gerencia a efetividade das células do sistema imunológico melhorando o prognóstico de doenças inflamatórias. Neste contexto, as MSC são estimuladas pela citocina inflamatória TNF-α, levando ao aumento da ciclo-oxigenase dois (COX-2). Isso resulta na síntese de prostaglandina E2 (PGE2): principal fator solúvel liberado pelas MSC. Baseado nisto, propõe-se que moléculas que mimetizam a ação da citocina atuam como novos moduladores de COX-2 e potencializam a ação as MSC na terapia. O objetivo deste estudo foi realizar um ensaio de triagem em larga escala para seleção de novas moléculas com ação sobre a MSC. Foram isoladas MSC de cordão umbilical (n=3) e caracterizadas quanto a morfologia, o perfil imunofenotípico e a capacidade de diferenciação. Após isso, testou-se nas três linhagens a modulação do eixo TNF-α- COX-2 quanto a secreção de PGE2 por ELISA e expressão gênica e proteica de COX-2 por qPCR e Western Blot (WB), respectivamente. A linhagem escolhida seguiu para a triagem em larga escala. Para tanto, usou-se qPCR e o método de ΔΔCT. No ensaio, as células foram tratadas com a condição de modulação positiva TNF-α, modulação negativa DMSO 0,5%, condição controle (somente meio base) e uma biblioteca de 707 moléculas, individualmente, a 50 µM. A molécula selecionada na triagem seguiu para a validação por qPCR, WB e curva dose-resposta. As MSC do cordão umbilical (UC-MSC, n=3), apresentaram-se como células aderentes ao plástico e fibroblastoides. Mais de 95% delas foram positivas para CD73, CD90 e CD105 e mostraram ausência (menos de 2%) de marcadores hematopoéticos e HLA-DR. Todas foram capazes de se diferenciar em adipócitos, osteócitos e condrócitos. Dentre as três linhagens, UC-MSC 01-03, a 03 apresentou o maior nível de secreção de PGE2 e acréscimos na expressão gênica e proteica de COX-2. Logo, ela foi a escolhida para a triagem. As sondas de hidrólise para B2M (gene endógeno) e COX-2 (gene alvo) foram otimizadas em cerca de 90% de eficiência e apresentaram comportamento semelhante. Com base na distribuição da expressão gênica dos controles TNF-α e DMSO, foram estabelecidos os parâmetros de seleção. A molécula selecionada foi a indirubina, um produto natural derivado de plantas e apontado na literatura como anti-inflamatório. Nas concentrações de 25 e 50 µM, ela aumentou a expressão gênica de COX-2 em cerca 4 a 8 vezes, respectivamente. No WB, essas concentrações demonstraram bandas com maior intensidade em comparação às demais. A curva de dose-resposta indicou que é necessário investigar concentrações mais altas para classificar nível da modulação e determinar o EC50. Até o momento, conclui-se que o ensaio de larga escala proposto foi capaz de selecionar a indirubina como molécula moduladora de COX-2. No entanto, ainda é necessário investigar a intensidade desta modulação e aplicação funcional na propriedade imunomoduladora das UC-MSC.

In cell therapy, the mesenchymal stromal cells (MSC) application is due to their immunomodulatory property. In this process, the MSC paracrine effect regulates the immune system cells improving the prognosis of inflammatory diseases. In this context, MSCs are stimulated by the inflammatory cytokine TNF-α increasing cyclooxygenase two (COX-2) expression. This results in the synthesis of prostaglandin E2 (PGE2): the main soluble factor released by MSC. Based on this, it is hypothesized that molecules that mimic cytokine role act as new COX-2 modulators and improve MSC in therapy. According to this, our goal was to perform a high throughput screening (HTS) assay to select new molecules. MSCs were isolated from the umbilical cord (n=3). The characterization considered the morphology, the immunophenotypic profile and the ability to differentiate. After that, in the three cell lines obtained the regulation of the TNF-α - COX-2 axis was tested regarding PGE2 secretion by ELISA and gene and protein expression of COX-2 by qPCR and Western Blot (WB), respectively. The chosen cell line was used to perform the HTS by qPCR and the ΔΔCT method. In the assay, cells were treated to TNF-α for positive modulation, DMSO 0.5% as negative, control condition (only media) and 707 molecules, individually, at 50 µM. The molecule selected in the HTS was validated by qPCR, WB, and dose-response curve. Umbilical cord MSC (UC-MSC, n=3) showed as plastic-adherent and spindle cells. More than 95% of them were positive for CD73, CD90 and CD105 and lack (less than 2%) of hematopoietic markers and HLA-DR. All were able to differentiate into adipocytes, osteocytes, and chondrocytes. Among the three UC-MSC, the sample 03 showed the highest level of PGE2 secretion and COX-2 gene and protein expression and then was chosen for screening. The hydrolysis probes for B2M (endogenous gene) and COX-2 (target gene) were optimized at about 90% efficiency and similar slope. Based on the gene expression distribution of TNF-α and DMSO controls the selection parameters were stablished. The selected molecule was indirubin, a natural product derived from plants, and mentioned in the literature as an anti-inflammatory. At concentrations of 25 and 50 µM, COX-2 gene expression 4 to 8-fold changed, respectively. In WB, these concentrations showed intense bands compared to the others. The dose-response curve indicated that it is necessary to investigate higher concentrations to classify modulation level and determine EC50. So far, it has been concluded that the HTS assay was able to select indirubin as a COX-2 modulator molecule. However, it is still necessary to investigate the intensity of this modulation and functional application in the immunomodulatory property of UC-MSC.