A transferência adotiva de linfócitos T modificados para expressar receptores de antígeno quiméricos (CAR) anti-CD19 tem resultado em taxas de remissão completa superiores a 80% em pacientes com leucemia linfoblástica aguda de células B. Entretanto, a resposta clínica é inferior (~30%) mesmo em outras neoplasias de células B, como a leucemia linfocítica crônica. Em tumores sólidos, o desafio é ainda maior, pois as células T-CAR apresentam-se ineficientes devido à baixa persistência, dificuldade de infiltração e exaustão funcional. Como alternativa para elevar a eficácia das células T-CAR, evidências pré-clínicas indicam que linfócitos polarizados para o fenótipo T helper 17 (Th17) são mais eficientes na erradicação de tumores do que células Th1. A polarização para Th17 in vitro envolve o cultivo das células com coquetel de citocinas e anticorpos neutralizantes, que é um processo dispendioso para a manufatura de células T-CAR. Em resposta às citocinas, o fator de transcrição receptor órfão relacionado ao ácido retinoico gama 2 (RORγt) orquestra a polarização para Th17. Assim, hipotetizamos que a coexpressão do CAR e de RORγt em células T humanas geraria células T-CAR com fenótipo Th17. Para testar nossa hipótese, produzimos vetores lentivirais contendo os genes codificantes do CAR anti-CD19 e/ou RORγt (para produção das rTh17-CAR). Para fins de comparação, também estabelecemos o método de polarização em Th17 por cultivo com citocinas e anticorpos (cTh17). Após a transdução, avaliamos a citotoxicidade das células T-CAR in vitro e in vivo contra células Raji modificadas para expressar luciferase. A citotoxicidade in vitro foi monitorada durante cocultivo com células Raji pela quantificação da bioluminescência e a liberação de IL-17 e IFN-γ foi mensurada por ELISA. Durante o estabelecimento da polarização em Th17 por citocinas, observamos que o uso do agonista de RORγt aumentou em ~45% a transcrição de IL-17A, sem alterar a transcrição de RORC2. Portanto, adicionamos o agonista de RORγt ao protocolo de produção das cTh17. Após transdução para expressar CAR e/ou RORγt, células cTh17-CAR, rTh17-CAR e CD4-CAR misturadas com células CD8-CAR na proporção 1:1 apresentaram citotoxicidade in vitro semelhante contra células de linfoma CD19+. Observamos também que as células CD4-CAR e cTh17-CAR exibem citotoxicidade na ausência de células CD8. Ainda, a coexpressão de CAR e RORγt gerou células T-CAR com perfil Th17, definido pela secreção de IL-17 (~1000 pg/mL/24h). A secreção de IL-17 por células cTh17 foi de ~2000 pg/mL/24h e células não polarizadas apresentaram secreção insignificante. Em um modelo in vivo de linfoma disseminado, as populações rTh17-CAR/CD8-CAR e cTh17-CAR/CD8-CAR apresentaram uma capacidade antitumoral inferior às CD4-CAR/CD8-CAR convencionais, indicando que a atividade superior das Th17 antitumorais pode depender do tipo de neoplasia. Compreender essas particularidades é essencial para aproveitar ao máximo o potencial terapêutico das células Th17. Concluímos que a superexpressão de RORγt gera células com perfil Th17, cuja eficácia tem sido demonstrada em modelos pré-clínicos de neoplasias sólidas. Nossos dados estabelecem uma estratégia simplificada para manufatura de células T-CAR com fenótipo Th17, que pode ser aplicada para avaliação da eficácia terapêutica desta população em outras neoplasias.

Adoptive transfer of T cells engineered to express anti-CD19 chimeric antigen receptors (CAR) has resulted in complete remission rates above 80% in patients with B-cell acute lymphoblastic leukemia. However, the clinical response is poor (~30 %) even in other B-cell neoplasms, such as chronic lymphocytic leukemia. Solid tumors have been even more challenging, as CAR-T cells face obstacles such as low persistence, low infiltration and functional exhaustion. As an alternative to increase the effectiveness of CAR-T cells, preclinical evidence indicates that lymphocytes polarized to the T helper 17 phenotype (Th17) are more efficient in eradicating tumors than Th1 cells. Polarization to Th17 in vitro involves culturing the cells with a cocktail of cytokines and neutralizing antibodies, which increases the complexity and the cost of manufacturing. In response to cytokines, the transcription factor retinoic acid gamma 2-related orphan receptor (RORγt) orchestrates the polarization to Th17. Thus, we hypothesized that the co-expression of a CAR and RORγt in human T cells would generate CAR-T cells with a Th17 phenotype. To test our hypothesis, we produced lentiviral vectors containing the genes encoding the anti-CD19 CAR and/or RORγt (for the production of rTh17-CAR). For comparison purposes, we also established a Th17 polarization method through culture with cytokines and antibodies (cTh17). After transduction, we evaluated the cytotoxicity of CAR-T cells in vitro and in vivo against Raji cells modified to express luciferase. In vitro cytotoxicity was monitored during co-culture with Raji cells by bioluminescence quantification, and IL-17 and IFN-γ release was measured by ELISA. During the establishment of Th17 polarization with cytokines, we observed that the use of the RORγt agonist increased the transcription of IL-17A by ~45%, without changing the transcription of RORC2. Therefore, we included the RORγt agonist to the cTh17 production protocol. After transduction to express CAR and/or RORγt, cTh17-CAR, rTh17-CAR and CD4-CAR cells mixed with CD8-CAR cells in a 1:1 ratio showed similar in vitro cytotoxicity against CD19+ lymphoma cells. We also observed that CD4-CAR and cTh17-CAR cells exhibited cytotoxicity in the absence of CD8+ cells. Furthermore, the co-expression of CAR and RORγt generated CAR-T cells with a Th17 profile, defined by IL-17 secretion (~1000 pg/mL/24h). IL-17 secretion by cTh17 cells was ~2000 pg/mL/24h and non-polarized cells showed negligible secretion. In an in vivo model of disseminated lymphoma, rTh17-CAR/CD8-CAR and cTh17-CAR/CD8-CAR populations had a lower antitumor capacity than conventional CD4-CAR/CD8-CAR, indicating that the superior antitumor Th17 activity reported by previous studies may depend on the tumor type. Understanding these particularities is essential to benefit from the therapeutic potential of Th17 cells. We conclude that RORγt overexpression generates cells with a Th17 profile, whose efficacy has been demonstrated in preclinical models of solid neoplasms. Our data establish a simplified strategy for the manufacture of CAR-T cells with Th17 phenotype that can be used to evaluate the therapeutic efficacy of this population in other neoplasms.