Tem sido recentemente demonstrado que a vacina pCDNA3-hsp65 apresenta atividade profilática e terapêutica na tuberculose experimental. Essa vacina é constituída do gene hsp65 Mycobacterium leprae e fragmento downstream de 1324 pb. Entretanto, uma investigação mais refinada da resposta imune desencadeada por diferentes fragmentos do inserto dessa vacina ainda não foi realizada. Também, não foi estudada, a influência do fragmento downstream ao gene hsp65 na indução da resposta imune pela vacina. Para tal propósito, foram construídos subclones da vacina pCDNA3-hsp65, com a colaboração da Dra. Sylvia Cardoso Leão (UNIFESP), para utilização nos esquemas de imunização e nos ensaios para avaliar a resposta imune humoral e celular. As novas construções de DNA foram denominadas pCDNA3-hsp65G (G = gene hsp65, para diferenciar da construção vacinai original, que contém gene hsp65 + fragmento downstream), pCDNA3-N (N = N-terminal da proteína Hsp65), pCDNA3-N59 (N59 = 59 pb codificante da extremidade N-terminal da Hsp65) e pCDNA3-DS (DS = downstream). Camundongos BALB/c foram imunizados por via intradérmica (Gene Gun) ou via intramuscular, com 10 µg/dose ou 100 µg/dose, respectivamente. Foram feitas três imunizações com intervalo de 15 dias entre elas; 30 dias após a 3a imunização, os animais foram sacrificados e a resposta imune foi avaliada. A resposta imune humoral foi avaliada pelos títulos de anticorpos IgG, lgG1 e lgG2a anti-Hsp65 através de ELISA. A resposta imune celular foi avaliada utilizando três parâmetros: proliferação de células totais do baço e linfonodos inguinais por incorporação de timidina triciada, produção das citocinas IL-4, IL-10, IFN-gama e IL-12 Hsp65-específicas por ELISA e determinação do influxo de linfócitos B, linfócitos T CD4+ e CD8+, macrófagos e células dendríticas para o baço dos animais imunizados com as construções de DNA. Por via intradérmica (Gene Gun), as imunizações com as construções a construção vacinai original pCDNA3-hsp65 e pCDNA3-hsp65G, construção contendo somente o gene hsp65 de Mycobacterium leprae, induziram elevados níveis de anticorpos IgG, lgG1 e lgG2a anti-Hsp65. Essas construções também induziram resposta imune celular específica. Células totais do baço e linfonodos inguinais dos animais imunizados com pCDNA3-hsp65 e pCDNA3-hsp65G proliferaram significativamente na presença de Hsp65 recombinante. A produção das citocinas IL-10, IFN-gama e IL-12 antígeno específica foi elevada, caracterizando um perfil misto Th1/Th2, porém com tendência a resposta Th2. Esse dado corroborou com os elevados títulos de anticorpos lgG1 e lgG2a. Também verificou-se um aumento no influxo de macrófagos, células dendríticas, linfócitos B, linfócitos T CD4+ e T CD8+ no baço dos animais imunizados em relação aos grupos controles (pCDNA3 e não imunizado). Entretanto, a resposta imune humoral e celular desencadeada pela construção vacinai original pCDNA3- hsp65 foi maior que aquela induzida por pCDNA3-hsp65G. As construções pCDNA3-N, pCDNA3-DS e pCDNA3-N59 não induziram resposta imune específica. Por via intramuscular, as construções pCDNA3-hsp65, pCDNA3-hsp65G e pCDNA3-N induziram elevados títulos de IgG, lgG1 e lgG2a anti-Hsp65, proliferação celular e produção significativa das citocinas avaliadas e aumento do influxo de macrófagos, células dendríticas, linfócitos B, linfócitos T CD4+ e CD8+ em comparação com os controles (pCDNA3 e não imunizado). Um perfil Th1 de resposta é induzido por pCDNA3-hsp65, pCDNA3-hsp65G e pCDNA3-N, quando injetadas por via intramuscular, uma vez que elevados níveis de IFN-gama e IL-12, além de elevados títulos de lgG2a, foram detectados. Entretanto, não foram verificadas diferenças na ativação da resposta imune humoral e celular quando as construções pCDNA3-hsp65 e pCDNA3-hsp65G foram comparadas. A construção pCDNA3-N desencadeou resposta imune em menor magnitude que as construções pCDNA3-hsp65 e pCDNA3-hsp65G. As demais construções (pCDNA3-N59 e pCDNA3-DS) não foram imunogênicas. Esses resultados indicaram que a ausência do fragmento downstream ao gene hsp65 interfere significativamente na ativação da resposta imune humoral e celular pela vacina, quando os animais foram imunizados por via intradérmica (Gene Gun) com pCDNA3-hsp65G, construção que não contém o fragmento downstream. Isso sugeriu que existe a provável participação de motifs CpG, presente no fragmento downstream, na indução da resposta imune, que foi significativamente diminuída quando esse fragmento foi retirado da construção de DNA pCDNA3-hsp65G. Por outro lado, por via intramuscular, o fragmento downstream parece não interferir no desencadeamento da resposta imune humoral e celular pela vacina. Essas diferenças na indução da resposta imune pelo fragmento downstream parecem estar diretamente relacionadas com a quantidade de DNA que é injetada nos animais e com a via de administração do DNA.

Recently, it had been demonstrated that pCDNA3-hsp65 DNA vaccine has prophylactic and therapeutic activities in experimental tuberculosis. This vaccine contains hsp65 gene from Mycobacterium leprae and 1324 bp downstream fragment. However, an investigation more refined of immune response triggered by different fragments from vaccine insert was not performed. Also, the influence of 1324 bp downstream fragment to induce immune response was not studied. Thus, DNA constructs were engineered from pCDNA3-hsp65 vaccine. These new DNA constructs were called pCDNA3-hsp65G (G = hsp65 gene, to differ of pCDNA3-hsp65, that contain hsp65 gene and 1324 bp downstream fragment), pCDNA3-N (N = Hsp65 N-terminal), pCDNA3-N59 (N59 = 59 bp codifying Hsp65 N-terminal) e pCDNA3-DS (DS = downstream). BALB/c mice were immunized by intradermal (Gene Gun) and intramuscular route, with 10 µg/dose and 100 µg/dose, respectively. Three immunizations were performed with 15 days between each one; 30 days after the last immunization, the mice were sacrificed and the immune response was evaluated. The humoral immune response was evaluated by anti-Hsp65 IgG, lgG1 and lgG2a antibody titles by ELISA. The cellular immune response was evaluated using three parameters: proliferation of spleen and lymph nodes cells by thimide tritiated incorporation, production of IL-4, IL-10, IFN-γ, IL-12 Hsp65- specific by ELISA and determination of B, T, T CD4+ and T CD8+ lymphocytes, macrophages and dendritic cells influx to spleen of the immunized mice. By intradermal (Gene Gun) route, the immunizations with pCDNA3-hsp65 and pCDNA3-hsp65G induced high anti-Hsp65 IgG, lgG1 and lgG2a antibody titles. These DNA constructs also triggered specific cellular immune response. Spleen and lymph node cells from mice immunized with leveis pCDNA3-hsp65 and pCDNA3-hsp65G proliferated significantly with recombinant Hsp65. The leveis of IL-4, IL-10, IFN-γ and IL-12 antigen-specific was high, characterizing Th1/Th2 profile, but tending to Th2 response. These data correlated to high lgG1 and lgG2a antibody titles. Also, it was found that there is a influx of macrophages, dendritic cells and lymphocytes B, T, T CD4+ and T CD8+ into mice spleens in relation to control groups (pCDNA3 and non immunized). However, the humoral and cellular immune response were not evoked by pCDNA3-hsp65 was higher than that one triggered by pCDNA3-hsp65G. The pCDNA3-N, pCDNA3-N\DS and pCDNA3-N59 did not induce specific immune response. By intramuscular route, pCDNA3-hsp65, pCDNA3-hsp65G and pCDNA3-N induced high anti-Hsp65 IgG, lgG1 and lgG2a, cellular proliferation, significant cytokine leveis and increase of macrophages, dendritic cells, lymphocytes influx comparing to contrais (pCDNA3 and non immunized). Th1 response was evoked by these DNA constructs because it was detected high IFN-y and IL-12 leveis and lgG2a titles. It not found differences in humoral and cellular immune response evoked by pCDNA3-hsp65 and pCDNA3-hsp65G. The pCDNA3-DS and pCDNA3-N59 were not immunogenic. These results indicated that the absence of downstream fragment interfere significantly in immune response activation, when mice were immunized by intradermal route with pCDNA3-hsp65, construct that not contain downstream fragment. This suggest that there is a putative participation of CpG motifs, contained into downstream fragment, to induce immune response, that was decreased when this fragment was excised. By the other hand, by intramuscular route, the downstream fragment interfere in immune response triggering. It is believed that these differences in role of downstream fragment is related with DNA quantity injected into mice and administration route.