Sepse é definida como uma doença que acarreta disfunções de órgãos com risco a vida em decorrência de uma resposta inflamatória desregulada do hospedeiro à uma infecção. Estima-se uma ocorrência anual de 48,9 milhões de casos de sepse acarretando potencialmente 11 milhões de mortes em todo o mundo. Apesar de inúmeras tentativas de implementar imunoterapias que modulem moléculas relevantes na patogênese da sepse, até o momento nenhuma abordagem apresentou eficácia clínica. Assim, sugere-se que a patogênese da sepse não é completamente conhecida e mais estudos são necessários para a identificação de novos alvos terapêuticos. Neste sentido, nosso objetivo foi identificar os mecanismos moleculares e celulares da resposta imunológica que estão associados com a suscetibilidade de camundongos isogênicos, com mesma idade, sexo e mantidos nas mesmas condições ambientais, submetidos a sepse de mesma intensidade, e em decorrência identificar novos alvos para terapia. Inicialmente, observamos diferentes desfechos quando induzimos sepse de mesma intensidade pelo modelo de ligadura e perfuração do ceco (CLP) em camundongos isogênicos, do mesmo sexo, idade e criados nas mesmas condições ambientais. Embora não observarmos diferenças nas concentrações plasmáticas de citocinas após 6 horas da indução de sepse entre camundongos sobreviventes e não sobreviventes, nos tempos de 12 h, 24 h e 48 h, os camundongos que sobreviveram à sepse apresentaram concentrações reduzidas dessas citocinas, enquanto nos camundongos não sobreviventes essas concentrações permaneceram mais elevadas. De acordo com dados anteriormente publicados na literatura, observamos que camundongos não sobreviventes também apresentaram um aumento da concentração plasmática de biomarcadores de lesões hepáticas, renais e cardíacas e bacteremia. Além disso, estes camundongos apresentaram concentrações aumentadas de quimiocinas e citocinas nos pulmões, rins, coração, fígado e também no foco primário da infecção (cavidade peritoneal) 24h após CLP. Em seguida, isolamos leucócitos de camundongos sobreviventes e não sobrevivente após 12 h da indução de sepse e realizamos análise de single cell RNA sequencing. Através da avaliação dos dados obtidos por redução dimensional, identificamos várias populações de leucócitos e observarmos aumento da frequência de neutrófilos imaturos em camundongos não sobreviventes. Além disso, observamos que neutrófilos maduros de camundongos não sobreviventes apresentaram aumento da produção de mediadores próinflamatórios e expressão de Hif1a e Cd274, gene que codifica a proteína PD-L1. Na literatura é descrito que estas moléculas estão associadas com o aumento do tempo de sobrevivência de neutrófilos e aumento da produção de neutrophils extracellular traps, que provem lesões de órgãos. Além disso, é descrito que interferon gama (IFN-gama) é capaz de induzir a expressão de PD-L1 em neutrófilos e acarretar aumento da promoção de lesão pulmonar em modelo de endotoxemia por LPS. Neste sentido, demonstramos que INF-gama é capaz de induzir a expressão de Hif1a e PD-L1 em neutrófilos, e ainda que camundongos Ifng-deficientes são mais resistentes a sepse e apresentaram menor indução de PD-L1 em neutrófilos. Em conclusão, observamos que camundongos isogênicos que cresceram sob as mesmas condições ambientais, interessantemente apresentam diferentes suscetibilidades à sepse por CLP. Neste contexto, camundongos não sobreviventes apresentaram manutenção da elevada inflamação sistêmica e aumento de lesões de tecidos. Além disso, neutrófilos de camundongos não sobreviventes apresentam expressão aumentada de PD-L1 e Hif1a, que pode ser promovida pela sinalização de IFN-gama. Desta forma, a modulação negativa de IFN-gama, PD-L1 e Hif1a podem ser potenciais alvos terapêuticos para a sepse.

Sepsis is defined as a life-threatening organ dysfunction caused by a dysregulated host response to infection. There is estimate an annual occurrence of 48.9 million cases of sepsis causing potentially 11 million deaths. Despite the attempt to implement immunotherapies modulating important molecules in the pathogenesis of sepsis, no approach showed efficacy in the clinics. This suggests that the pathogenesis of sepsis is not completely understood and that new methodologies may contribute to the identification of new therapeutic targets. In this context, the present work aimed to identify new therapeutic targets for sepsis analysis the molecular and cellular mechanisms related to the immune response responsible for the different outcomes of mice submitted to sepsis. Initially, by inducing the cecal ligation and puncture sepsis (CLP) in mice genetically equal and having the same grown-up environment, we observe different responses to sepsis in which half of the mice survive and the other half die from sepsis. Although we did not observe differences in the plasma concentrations of cytokines after 6 hours of sepsis induction between surviving and non-surviving mice, at 12 h, 24 h and 48 h, mice that survived sepsis showed reduced concentrations of these cytokines, while in non-survived mice these concentrations remained higher. Unsurprisingly, nonsurviving mice also showed increased plasma concentrations of biomarkers of liver, kidney and heart damage and bacteremia. Furthermore, these mice showed increased concentrations of chemokines and cytokines in the lungs, kidneys, heart, liver and also in the primary focus of infection (peritoneal cavity) 24h after CLP. Further, we isolated leukocytes from survived and non-survived mice after 12 h of sepsis induction and performed single cell RNA sequencing analysis. The evaluation of the data obtained by dimensional reduction revealed several populations of leukocytes, and we observed an increase in the frequency of immature neutrophils in non-survived mice. Furthermore, we observed that mature neutrophils from non-survived mice showed increased production of pro-inflammatory mediators and expression of Hif1a and Cd274, the gene that encodes the PD-L1 protein. In the literature it is described that these molecules are associated with increased neutrophil survival and increased production of neutrophil extracellular traps, which cause organ damage. Furthermore, it is described that interferon gamma (IFN-gamma) is able to induce PD-L1 expression in neutrophils and lead to increased promotion of lung injury in a model of endotoxemia by LPS. In this sense, we demonstrated that INF-gamma induced the expression of Hif1a and PD-L1 in neutrophils, and that Ifng-deficient mice are more resistant to sepsis and showed less induction of PD-L1 in neutrophils. In conclusion, we observed that isogenic mice grown under the same environmental conditions interestingly show different susceptibility to CLP sepsis. In this context, non-survived mice show maintenance of high systemic inflammation and increased tissue damage. Furthermore, neutrophils from non-survived mice show increased expression of PD-L1 and Hif1a, which can be promoted by IFN-gamma signaling. Thus, the negative modulation of IFN-gamma, PD-L1 and Hif1a may be potential therapeutic targets for sepsis.