Os astrócitos são as células gliais mais abundantes do sistema nervoso central (SNC) e essenciais para a manutenção da homeostase cerebral. No entanto, em condições patológicas como as observadas no modelo experimental de esclerose múltipla (EAE), sugere-se que a sua ativação é deletéria por amplificar a resposta inflamatória local. Recentemente, tem sido demonstrado uma interessante correlação entre inflamação e a promoção de vias metabólicas alternativas, como a via das hexosaminas (HBP, do inglês hexosamine biosynthesis pathway). O produto final da HBP é o UDP-Nacetilglucosamina que, por ação da enzima O-GlicosilTransferase (OGT), gera modificações pós-traducionais denominadas O-GlcNAcilação. A ocorrência da OGlcNAcilação tem sido associada com a ativação de células do sistema imunológico como macrófagos e linfócitos T, e com a progressão de certas doenças de cunho neurodegenerativo. Entretanto, a relação entre HBP e a O-GlcNAcilação em astrócitos permanece inexplorada no contexto da neuroinflamação. Através da utilização de estudos in vitro e in vivo, citometria de fluxo, análises transcricionais de larga escala, técnicas de imagem e quantificações de proteínas, o presente projeto teve como objetivo o melhor entendimento desses mecanismos. Após o estabelecimento de culturas primárias de astrócitos obtidos de camundongos neonatos, caracterizamos um método alternativo para o estudo dessas células em um sistema isolado. Sob estímulo de moléculas que mimetizam alguns aspectos da neuroinflamação (TNF, IL-1alfa e C1q) observamos uma significativa indução de IL-6, CCL2, CXCL1 e CXCL10. Nestas condições, a análise da expressão de enzimas crucias da via das HBP demonstrou uma correlação positiva com a indução dos transcritos da Ogt, Oga, Gfpt11/2. Uma série de experimentos funcionais utilizando inibidores farmacológicos dessas enzimas revelou que o bloqueio da OGA (OGliconAcase - catalisa a remoção do grupamento UDP-N-acetilglucosamina), via Thiamet G, impactou negativamente na promoção de IL-6 e CXCL1 frente a estímulos inflamatórios. Com o objetivo de explorar esses mecanismos in vivo, geramos animais Aldh1l1CreER/Ogtflox/flox nos quais a OGT pode ser geneticamente depletada em astrócitos pelo uso de tamoxifeno. Após a validação satisfatória dessa estratégia experimental, submetemos esses animais ao modelo de EAE e investigamos o papel funcional da OGT nos parâmetros clínicos da doença. Na ausência da OGT em astrócitos observou-se uma melhora significativa no desenvolvimento da doença, sugerindo um papel deletério da HBP na neuroinflamação. Por citometria de fluxo, observamos uma correlação significativa entre a deficiência de OGT e um menor infiltrado de células imunes no SNC desses animais. Tanto a proporção quanto o número absoluto de leucócitos, micróglia, linfócitos T (CD4+, Treg, Th17), macrófagos e células dendríticas foram afetados na ausência da OGT. Esses resultados sugerem que a expressão de OGT e, virtualmente, a O-GlcNAcilação de proteínas é responsável pela comunicação dos astrócitos com células imunes que infiltram o CNS de animais com EAE. O não envolvimento da OGT na produção de todos os mediadores inflamatórios em cultura, sugere um efeito independente de citocinas e quimiocinas classicamente descritas no EAE. Estudos posteriores investigando esses mecanismos em mais detalhes encontram-se em andamento no nosso grupo de pesquisa e poderão identificar potenciais alvos para o tratamento de doenças que acometem o SNC.

Astrocytes are the most abundant glial cells in the central nervous system (CNS) and essential for maintaining brain homeostasis. However, in pathological conditions such as those observed in the experimental model of multiple sclerosis (EAE), it is suggested that its activation is deleterious as it amplifies the local inflammatory response. Recently, an interesting correlation has been demonstrated between inflammation and the promotion of alternative metabolic pathways, such as the hexosamine biosynthesis pathway (HBP). The final product of HBP is UDP-N-acetylglucosamine which, by the action of the enzyme O-GlycosylTransferase (OGT), generates post-translational modifications called O-GlcNAcylation. The occurrence of O-GlcNAcylation has been associated with the activation of immune system cells such as macrophages and T lymphocytes, and with the progression of certain neurodegenerative diseases. However, the relationship between BPH and O-GlcNAcylation in astrocytes remains unexplored in the context of neuroinflammation. Through the use of in vitro and in vivo studies, flow cytometry, largescale transcriptional analyses, imaging techniques and protein quantification, this project aimed to better understand these mechanisms. After establishing primary cultures of astrocytes obtained from newborn mice, we characterize an alternative method for studying these cells in an isolated system. Under stimulus of molecules that mimic some aspects of neuroinflammation (TNF, IL-1alpha and C1q) we observed a significant induction of IL-6, CCL2, CXCL1 and CXCL10. Under these conditions, analysis of the expression of crucial enzymes in the BPH pathway showed a positive correlation with the induction of Ogt, Oga, Gfpt11/2 transcripts. A series of functional experiments using pharmacological inhibitors of these enzymes revealed that the blockade of OGA (OGliconAcase - catalyzes the removal of the UDP-N-acetylglucosamine group), via Thiamet G, negatively impacted the promotion of IL-6 and CXCL1 against stimuli inflammatory. In order to explore these mechanisms in vivo, we generated Aldh1l1CreER/Ogtflox/flox animals in which OGT can be genetically depleted in astrocytes by the use of tamoxifen. After the satisfactory validation of this experimental strategy, we submitted these animals to the EAE model and investigated the functional role of OGT in the clinical parameters of the disease. In the absence of OGT in astrocytes, a significant improvement in disease development was observed, suggesting a deleterious role for BPH in neuroinflammation. By flow cytometry, we observed a significant correlation between OGT deficiency and a lower infiltration of immune cells in the CNS of these animals. Both the proportion and the absolute number of leukocytes, microglia, T lymphocytes (CD4+, Treg, Th17), macrophages and dendritic cells were affected in the absence of OGT. These results suggest that OGT expression and, virtually, OGlcNAcylation of proteins is responsible for the communication of astrocytes with immune cells that infiltrate the CNS of animals with EAE. The non-involvement of OGT in the production of all inflammatory mediators in culture suggests an independent effect of cytokines and chemokines classically described in EAE. Further studies investigating these mechanisms in more detail are underway in our research group and may identify potential targets for the treatment of diseases that affect the CNS.