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Disertación de Maestría
DOI
https://doi.org/10.11606/D.17.2020.tde-21022020-141145
Documento
Autor
Nombre completo
Ricardo Souza Camargo
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
Ribeirão Preto, 2019
Director
Tribunal
Silva, João Santana da (Presidente)
Rodrigues Junior, Virmondes
Martinez, Roberto
Título en portugués
Papel do receptor NOD2 no controle da infecção por Paracoccidioides brasiliensis
Palabras clave en portugués
IL-17
Linfócito T gamma-delta
Nod2
Paracoccidioides brasiliensis
Rip2
Resumen en portugués
O receptor NOD2 (nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 2), pertencente à família dos receptores tipo NOD (NLRs), atua na detecção intracelular de peptídeoglicano conservado em bactérias. Utilizando a molécula adaptadora RIP2 para desencadear vias de sinalização pró-inflamatórias, o receptor NOD2 é caracterizado por sua ação na proteção contra infecções bacterianas. No entanto, trabalhos recentes veem demonstrando seu papel no controle da disseminação de patógenos não-bacterianos, assim como, sua influência na modulação da resposta imune adaptativa Th17. Levando em consideração que a resposta Th17 é importante para imunidade antifúngica e que não há relatos na literatura que correlacionem o envolvimento do receptor NOD2 com infecções fúngicas sistêmicas, nós decidimos investigar a sua ação durante a paracoccidioidomicose (PCM), micose granulomatosa sistêmica causada pelo fungo Paracoccidioides brasiliensis. Portanto, no presente estudo foram utilizados animais WT (C57Bl/6), Nod2-/- e Rip2-/- para avaliar a participação do receptor NOD2 e sua molécula adaptadora RIP2 na paracoccidioidomicose experimental. Os resultados obtidos, demonstraram que na ausência das moléculas NOD2 e RIP2 os animais se tornaram mais resistentes durante a PCM, apresentando menor carga fúngica nos dias 7, 15 e 30 após infecção. Durante análise histológica do pulmão, foi constatado que os animais Nod2-/- apresentavam granulomas mais organizados e presença maciça de leucócitos na porção interna do granuloma quando comparado aos animais controles. Para investigar a razão pela qual a ausência desta molécula proporciona a formação de granulomas mais compactos, foi dosado TNF-? de macrófagos derivados da medula óssea (BMDM) estimulado por P. brasiliensis e do homogenato pulmonar de camundongos infectados com P. brasiliensis no 15° dpi. Não foi encontrada diferença significativa na produção de TNF-? em ambos os grupos nas diferentes situações. No entanto, procurando explicação para tal fenômeno, as expressões dos genes IL-6 e IL-23p19 foram avaliadas por qPCR no 7° e 15° dpi a partir do tecido pulmonar dos camundongos infectados. Comparado aos camundongos WT e Rip2-/-, os animais Nod2-/- exibiram um aumento significativo da expressão de IL-6 e IL-23p19 durante o período de infecção estabelecido. Além disso, os animais Nod2-/- também apresentaram aumento da produção das citocinas IL-6 (7°, 15°dpi) e IL-23 (7°, 30°dpi) em relação aos camundongos WT e Rip2-/-. Este resultado sugere que o receptor NOD2 reprime a produção de IL-6 e IL-23 durante a PCM. Sabendo que essas citocinas induzem a síntese de IL-17, decidimos investigar sua produção durante a PCM. Como resultado, observamos que na ausência de NOD2 a produção de IL-17 estava potencializada nos dias 7 e 15 pi. Adicionalmente, identificamos por citometria de fluxo que os linfócitos CD3+ produtores de IL-17 presentes nos pulmões dos camundongos Nod2-/-, estavam em maior quantidade que nos animais controles (WT, Rip2-/-) no terceiro e sétimo dpi. Dentre as células CD3+ totais, identificamos que os linfócitos CD4+ dos camundongos Nod2-/- também produziam mais IL- 17. No entanto, descobrimos que os animais ausentes do receptor NOD2, a maior produção de IL-17 é proveniente dos linfócitos T??, fenômeno que não ocorre entre os camundongos WT e Rip2-/-. Com o intuito de investigar o papel do receptor NOD2 nos linfócitos CD4+, a partir dos linfócitos CD3+ naives isolados dos linfonodos e baço, fomos avaliar o seu efeito na polarização para Th17. Detectamos que os linfócitos Nod2-/- demonstrou uma maior polarização para o perfil Th17 quando comparados as células WT e Rip2-/-. Por fim, comparado aos grupos controles, os animais Nod2-/- apresentaram maior migração de neutrófilos na fase aguda da PCM. Em conclusão, estes dados mostram que o receptor NOD2 tem papel importante na suscetibilidade do hospedeiro durante a infecção por P. brasiliensis.
Título en inglés
The role of the NOD2 receptor in the control of Paracoccidioides brasiliensis infection
Palabras clave en inglés
Gamma-delta T lymphocyte
IL-17
Nod2
Paracoccidioides brasiliensis
Rip2
Th17 lymphocyte
Resumen en inglés
The NOD2 receptor (nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 2) is a member ofNOD receptor family (NLRs) which acts on the intracellular detection of bacterially conserved peptidoglycan. Using the RIP2 adaptor molecule to trigger proinflammatory signaling pathways, the NOD2 receptor is characterized by its function on recognition and protection against bacterial infections. However, recent studies have demonstrated its role in controlling the spread of non-bacterial pathogens, as well as its influence in the modulation of Th17 adaptive immune response. Taking into account that the Th17 response is important for antifungal immunity and that there are no reports in the literature correlating NOD2 receptor involvement with systemic fungal infections, we aimed to investigate its role during paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic granulomatous mycosis caused by Paracoccidioides brasiliensis. Therefore, in the present study WT (C57BL/6), Nod2-/- e Rip2-/- mice were used to evaluate the participation of NOD2 receptor and RIP2 in experimental paracoccidioidomycosis. The results show that in the absence of NOD2 and RIP2 molecule the animals were more resistant to PCM, presenting fewer colony-forming units (CFU) on days 7, 15 and 30 post infection. During lung histological analysis revealed that NOD2-/- mice presented more organized granulomas and massive presence of leukocytes inside the granuloma when compared to naïve control animals. To investigate the reason why the absence of this molecule results in the formation of compact granulomas, TNF-? levels were evaluated from P. brasiliensis stimulated bone marrow-derived macrophages (BMDM) and pulmonary homogenate from mice infected with P. brasiliensis at 15° pi. There was no significant difference in TNF-? production in both groups in different situations. However, IL-6 and IL- 23p19 gene expression were evaluated by qPCR at 7° and 15° from the lung tissue of infected mice. Comparing WT and Rip2-/- mice, the Nod2-/- animals showed a significant increase in IL- 6 and IL-23p19 expression during infection. In addition, Nod2-/- mice showed increased production of IL-6 (7°, 15° pi) and IL-23 (7°, 30° pi) compared to WT mice. This result suggests that the NOD2 receptor represses IL-6 and IL-23 production during PCM. Taking into consideration that these cytokines induce IL-17 synthesis, we found that in the absence of NOD2, IL-17 production was enhanced in the 7th and 15th dpi. Additionally, we identified by flow cytometry that the IL-17-producing CD3+ lymphocytes present in the lungs of Nod2-/- mice were higher than in the control animals (WT, Rip2-/-) in the third and seventh dpi. Among the total CD3+ cells, we identified that the CD4+ lymphocytes of Nod2-/- mice also produced more IL-17. However, we found that the absence of NOD2 receptor led to higher IL-17 production from lymphocytes T??, which does not occur in WT and Rip2-/- mice. To investigate the role of NOD2 receptor on CD4 +, CD3 + lymphocytes were isolated from naive lymph nodes and spleen, to evaluate the polarization to Th17. We detected that Nod2-/- lymphocytes showed a greater polarization for the Th17 profile when compared to WT and Rip2-/- cells. Finally, compared to the control groups, Nod2-/-animals presented higher neutrophil migration to the lungs in the acute phase of PCM. In conclusion, these data show that the NOD2 receptor plays an important role in host susceptibility during P. brasiliensis infection.
 
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Fecha de Publicación
2020-04-28
 
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