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Disertación de Maestría
DOI
https://doi.org/10.11606/D.17.2020.tde-21022020-133826
Documento
Autor
Nombre completo
Jefferson Elias Oliveira
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
Ribeirão Preto, 2019
Director
Tribunal
Faccioli, Lucia Helena (Presidente)
Castro, Fabíola Attié de
Martins, Maria Auxiliadora
Título en portugués
CD14 e TLR4 medeiam a inflamação pulmonar e mortalidade induzidas por Achromobacter xylosoxidans
Palabras clave en portugués
Achromobacter xylosoxidans
CD14
IL-6
Receptores da imunidade inata
TLR4
Resumen en portugués
Achromobacter xylosoxidans é um bacilo Gram-negativo, móvel, não formador de esporos, catalase positivo, não fermentador de glicose e resistente à diversos antimicrobianos. Este bacilo emergente vem sendo reportado como agente causador de pneumonias em indivíduos com fibrose cística (FC), e ceratite, osteomielite, artrite ou sepse em pacientes imunossuprimidos. A prevalência da infecção por A. xylosoxidans em pacientes com FC pode variar de 7,4% a 93,8%, porém, estima-se que em alguns países haja subnotificação, devido à dificuldade na identificação desse agente. A resistência à antibióticos e a capacidade de formar biofilme são os principais fatores que favorecem a permanência da bactéria no trato respiratório dos pacientes com FC, e contribuem para a exacerbação da doença. Em geral, a resposta imune ativada por bactérias Gram-negativas é dependente do reconhecimento do LPS, presente na superfície bacteriana, por receptores do tipo Toll (TLR), principalmente TLR2 e TLR4. Além disso, a ativação destes receptores requer frequentemente o auxílio de co-receptores, como CD14. O papel dos receptores da imunidade inata é bem conhecido para algumas bactérias Gram-negativas que também causam infecções respiratórias, porém ainda não há estudos da participação destes receptores na infecção por A. xylosoxidans. Neste trabalho, nosso objetivo foi avaliar o papel das moléculas CD14 e TLR4 durante a infecção experimental por A. xylosoxidans. Para tanto utilizamos camundongos C57Bl/6, deficientes de CD14 ou de TLR4 infectados com os bacilos via intratraqueal. Nestes animais, determinamos a curva de sobrevivência, e no 1º, 3º e 7º dias após infecção (d.p.i.), diferentes parâmetros foram avaliados nos pulmões, baço ou no sangue circulante. Observamos que 100% dos animais selvagens morrem em até cinco dias, enquanto 100% dos camundongos deficientes de CD14 ou TLR4 sobrevivem ao final de sete dias. No entanto, quando comparadas as três linhagens de animais, observamos que apenas camundongos deficientes de TLR4 apresentam maior carga bacteriana nos pulmões. Além disso, observamos que não ocorre disseminação de bactérias para outros tecidos, e nem diferenças na expressão gênica de Lipocalina-2 (Lcn2) e na produção de óxido nítrico (NO), sugerindo que a resistência dos camundongos Cd14-/- e Tlr4-/- à infecção não está relacionada com o controle da carga bacteriana. Interessante que, no 3º d.p.i., os pulmões de animais deficientes de CD14 ou de TLR4 apresentam menor área de lesão tecidual, menos recrutamento de neutrófilos, edema pulmonar menos intenso, e menor concentração de IL-6, TNF-?, CXCL1, CCL2, CCL3 e de LTB4. Observamos ainda que a infecção por A. xylosoxidans aumenta os níveis séricos de sCD14 e de IL-6, de forma dependente de CD14 ou TLR4. No entanto, 100% dos camundongos selvagens inoculados com bactérias mortas pelo calor sobreviveram e apresentam redução de IL-6 pulmonar e sérica, sugerindo que produtos liberados pelas bactéria vivas são responsáveis pela inflamação pulmonar e mortalidade. Em resumo, nossos dados mostram que a ativação de CD14 ou TLR4, possivelmente por LPS, induz inflamação pulmonar com intenso recrutamento de células, e consequente falência respiratória, resultando em morte dos animais. A citocina IL-6 parece ser o principal mediador deste processo. Assim, sugerimos que CD14 e TLR4 estão intimamente relacionadas com a patogênese da doença, constituindo importantes alvos terapêuticos.
Título en inglés
CD14 and TLR4 mediate Achromobacter xylosoxidans-induced pulmonary inflammation and mortality
Palabras clave en inglés
Achromobacter xylosoxidans
CD14
IL-6
Innate Immunity Receptors
TLR4
Resumen en inglés
Achromobacter xylosoxidans is a gram-negative, mobile, non-spore-forming, positive catalase, glucose-non-fermenting bacillus resistant to various antimicrobials. This emerging bacillus is reported to cause pneumonia in patients with cystic fibrosis (CF), keratitis, osteomyelitis, arthritis, or sepsis in immunosuppressed patients. The prevalence of A. xylosoxidans infection in CF patients may range from 7.4% to 93.8%, however, it is estimated that in some countries underreporting due to the difficulty of identifying this agent. Antibiotic resistance and the ability to form biofilm are the main factors that favor the permanence of the bacteria in the respiratory tract of CF patients, and contribute to the exacerbation of the disease. In general, an immune response activated by Gram-negative bacteria depends on the recognition of LPS present on the bacterial surface by Toll-like receptors (TLR), mainly TLR2 and TLR4. In addition, activation of these receptors often requires the aid of coreceptors such as CD14. The role of innate immunity receptors is well known for some gramnegative bacteria that also cause respiratory infections, but there are no studies on their participation in A. xylosoxidans infection. In this work, our objective was to evaluate the role of CD14 and TLR4 during the experimental A. xylosoxidans infection. For this purpose, we used C57Bl/6 and CD14 or TLR4 deficient mice infected with bacilli via intratracheal route. In these animals, we determined the survival curve, and on days 1, 3, and 7 days post infection (d.p.i.), different parameters were evaluated in the lungs, spleen or circulating blood. We observed that 100% of wild animals die within five days, while 100% of CD14 or TLR4 deficient mice survive after seven days. However, when comparing the three animal strains, we observed that only TLR4 deficient mice show higher bacterial load in the lungs. In addition, we observed that bacteria do not spread to other tissues, nor do differences in lipocalin-2 (Lcn2) gene expression and nitric oxide (NO) production, suggesting that the resistance of Cd14-/- and Tlr4-/- mice to infection is not related to bacterial load control. Interestingly, at 3dpi, the lungs of CD14 or TLR4-deficient animals have a smaller area of tissue injury, less neutrophil recruitment, less intense pulmonary edema, and a lower concentration of IL-6, TNF-?, CXCL1, CCL2, CCL3 and LTB4. We also observed that infection by A. xylosoxidans increases sCD14 and IL-6 serum levels, depending on CD14 or TLR4. However, 100% of wild mice inoculated with heat-killed bacteria survived and had reduced pulmonary and serum IL-6, suggesting that products released by living bacteria are responsible for lung inflammation and mortality. In summary, our data show that activation of CD14 or TLR4, possibly by LPS, induces pulmonary inflammation with intense cell recruitment, and consequent respiratory failure, resulting in animal death. Cytokine IL-6 seems to be the main mediator of this process. Thus, we suggest that CD14 and TLR4 are closely related to the pathogenesis of the disease, constituting important therapeutic targets.
 
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Fecha de Publicación
2020-04-30
 
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