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Dissertação de Mestrado
DOI
10.11606/D.17.2019.tde-20112018-112928
Documento
Autor
Nome completo
Ricardo Cardoso Castro
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2018
Orientador
Banca examinadora
Frantz, Fabiani Gai (Presidente)
Báfica, André Luiz Barbosa
Bonato, Vania Luiza Deperon
Santana, Rodrigo de Carvalho
Título em português
Papel da sinalização Notch na resposta contra Mycobacterium tuberculosis a relação com o desenvolvimento da forma ativa da tuberculose humana
Palavras-chave em português
biomarcador de progressão
resposta imune
sinalização Notch
tuberculose ativa
Resumo em português
A tuberculose (TB) é uma doença infecciosa bacteriana causada por Mycobacterium tuberculosis (Mtb), acomete seres humanos em todo mundo, e é considerada uma das principais causas de morbidade e mortalidade dentre as doenças infecciosas. Nesse cenário, a TB ainda é vista como um grande desafio para a ciência e para medicina. Com o estudo de novos alvos moleculares para terapia e diagnóstico, por exemplo, a sinalização Notch tem sido descrita como uma via importante para a manutenção da resposta imunológica durante a infecção por Mtb. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a participação da via Notch na modulação da resposta imune durante a infecção por Mtb em humanos. Neste trabalho foram incluidos 13 pacientes com tuberculose ativa e 13 indivíduos saudáveis. Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram isoladas e avaliadas quanto à expressão de receptores Notch 1 - 2 em células T e ligantes Notch, DLL1 - 4 em subpopulações de monócitos por citometria de fluxo e expressão de genes relacionados à via Notch e resposta imune. Além disso, o plasma foi utilizado para avaliar níveis de citocinas, CD14s e CD163s. Ainda, avaliamos a função celular dependente da ativação da via Notch durante a infecção de células mononucleares de sangue periférico de indivíduos saudáveis com Mtb H37Rv in vitro. Observamos que pacientes com TB ativa apresentaram aumento na expressão de DLL4 em monócitos intermediários e não-clássicos e diminuição na expressão de Notch 2 em células T CD8+. In vitro, observamos nas culturas de PBMCs, aumento da expressão de DLL4 em monócitos intermediários e Notch 2 em células T CD4+. A expressão do ligante DLL4 em monócitos intermediários e a expressão do Notch 1 em células T CD4+ em pacientes com TB ativa se correlacionaram positivamente com o grau de lesão pulmonar. Além disso, pacientes com quadros de lesão pulmonar moderado e avançado têm maior expressão de Notch 1 em células T CD4+ quando comparados a pacientes com grau mínimo de lesão pulmonar. Pacientes com TB ativa apresentam aumento significativo nos níveis plasmáticos de IL-6, IP- 10, CD14s e CD163s e diminuição nos níveis de IFN-?, IL-17A, IL-4, IL-2, IL-1? e RANTES. Os níveis plasmáticos de IFN-?, TNF-?, IL-17A, IL-4, IL-2, IL-12, IL-1?, RANTES e IL-10 se correlacionaram positivamente com o maior grau de lesão pulmonar.Além disso, demonstramos que os níveis de IFN-?, IL-17A, IL-1?, IL-4 e IL-2 se relacionam com maior expressão do receptor Notch 1 em células T CD4+ , enquanto níveis plasmáticos de IP-10, CD163s e de procalcitonina se correlacionam com maior expressão de Notch 1 em células T CD8+. Evidenciamos maior tendência na expressão de HES1 em pacientes com TB ativa e células infectadas in vitro, indicando que a via Notch está sendo ativada durante a infecção por Mtb. De forma interessante, in vitro as culturas de PBMCs tratadas com inibidor farmacológico da via Notch (GSI), reduziram a produção de IL-17A, IL-2 e IL-10 e aumentaram IL-8, enquanto o tratamento com anti-hDLL4 promoveu o aumento significativo nos níveis de TNF-? e atividade fagocítica de monócitos. Em conclusão, a expressão de receptores e ligantes Notch é alterada durante a TB, em especial o ligante DLL4 em subpopulações de monócitos. Além disso, a via Notch parece ser importante na modulação de respostas pró e anti-inflamatórias. Nesse trabalho, sugerimos que a expressão de Notch 1 em células T e DLL4 em subpopulações de monócitos estão associados com a gravidade da TB. Assim, a detecção desses constituintes da via Notch em PBMCs de pacientes com TB ativa são potenciais biomarcadores para avaliar a progressão da doença.
Título em inglês
Role of Notch signaling in the response against Mycobacterium tuberculosis in relation to the development of the active form of human Tuberculosis
Palavras-chave em inglês
active tuberculosis
immune response
Notch signaling
progression biomarker
Resumo em inglês
Tuberculosis (TB) is a bacterial infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), affects humans worldwide, and is considered a major cause of morbidity and mortality among infectious diseases. In this scenario, TB is still seen as a major challenge for science and medicine. With the study of new molecular targets for therapy and diagnosis, for example, Notch signaling has been described as an important pathway for the maintenance of immune response during Mtb infection. Thus, the objective of this work was to evaluate the participation of the Notch pathway in the modulation of the immune response during Mtb infection in humans. In this study, 13 patients with active tuberculosis and 13 healthy individuals were included. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated and evaluated for Notch 1 - 2 receptor expression in T cells and Notch, DLL1 - 4 ligands in monocyte subpopulations by flow cytometry and expression of Notch - pathway related genes and immune response. In addition, plasma was used to assess levels of cytokines, CD14s and CD163s. Furthermore, we evaluated the cellular function dependent on the activation of the Notch pathway during the infection of peripheral blood mononuclear cells of healthy subjects with Mtb H37Rv in vitro. We observed that patients with active TB had increased DLL4 expression in intermediate and nonclassic monocytes and decreased expression of Notch 2 in CD8+ T cells. In vitro, we observed in the cultures of PBMCs, increased expression of DLL4 in intermediate monocytes and Notch 2 in CD4+ T cells. The expression of the DLL4 linker in intermediate monocytes and the expression of Notch 1 in CD4+ T cells in patients with active TB correlated positively with the degree of lung injury. In addition, patients with moderate and advanced lung injury have higher Notch 1 expression in CD4+ T cells when compared to patients with a minimal degree of lung injury. Patients with active TB showed a significant increase in plasma levels of IL-6, IP-10, CD14s and CD163s, and decreased levels of IFN-?, IL-17A, IL-4, IL-2, IL-1? and RANTES. The plasma levels of IFN-?, TNF-?, IL-17A, IL-4, IL-2, IL-12, IL-1?, RANTES and IL-10 correlated positively with the highest degree of lung injury. In addition, we demonstrated that levels of IFN-?, IL-17A, IL-1?, IL-4 and IL-2 are related to higher Notch 1 receptor expression in CD4+ T cells, whereas plasma levels of IP-10,CD163s and procalcitonin correlate with increased Notch 1 expression in CD8+ T cells. We have shown a greater trend in HES1 expression in patients with active TB and in vitro infected cells, indicating that the Notch pathway is being activated during Mtb infection. Interestingly, in vitro cultures of PBMCs treated with the Notch pharmacological inhibitor (GSI), reduced IL-17A, IL-2 and IL-10 production and increased IL-8, while anti-hDLL4 treatment promoted the significant increase in TNF-? levels and monocyte phagocytic activity. In conclusion, the expression of Notch receptors and ligands is altered during TB, especially the DLL4 linker in monocyte subpopulations. In addition, the Notch pathway appears to be important in modulating pro and anti-inflammatory responses. In this work, we suggest that Notch 1 expression in T cells and DLL4 in monocyte subpopulations is associated with TB severity. Thus, detection of these constituents of the Notch pathway in PBMCs of patients with active TB are potential biomarkers to assess disease progression.
 
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Ricardo.pdf (2.80 Mbytes)
Data de Publicação
2019-02-07
 
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