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Master's Dissertation
DOI
https://doi.org/10.11606/D.17.2021.tde-11062021-074015
Document
Author
Full name
Priscila Cristina Corrêa
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Ribeirão Preto, 2021
Supervisor
Committee
Castelo, Ademilson Panunto (President)
Cabral, Hamilton
Guazzaroni, María Eugenia
Title in Portuguese
Isolamento de uma α-manosidase de Paracoccidioides brasiliensis e determinação de seu papel na relação fungo-hospedeiro
Keywords in Portuguese
α-Manosidase
Glicosidase
Hidrolase glicosídica
Paracoccidioides
Abstract in Portuguese
Os fungos termodimórficos do gênero Paracoccidioides causam a paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica endêmica em países da América do Sul, incluindo o Brasil, que detém cerca de 85% dos casos de PCM. À temperatura ambiente, os fungos se apresentam na forma filamentosa (hifa), que quando inalada por seres humanos na forma de propágulos ambientais do fungo, a temperatura corpórea (37ºC) induz a transformação do fungo para levedura, a forma de resistência e patogênica do fungo, levando a uma inflamação crônica, principalmente nos pulmões. Em estudos preliminares, identificou-se no sobrenadante de culturas do isolado Pb18 de P. brasiliensis a presença de uma α-manosidase vacuolar. Ao se avaliar a expressão gênica desta α-manosidase observou-se uma correlação positiva entre a expressão gênica da proteína e a virulência de P. brasiliensis, uma vez que se mostrou-se significativamente maior nos transcritos obtidos em leveduras do que em micélio em isolados com diferentes graus de virulência, mantendo-se elevada em leveduras da linhagem virulenta cultivada em diferentes meios de cultura. No presente trabalho foi realizado o isolamento da proteína do sobrenadante de cultura de leveduras de Pb18 utilizando cromatografia de troca aniônica, em pH 8,0, em que a enzima manteve suas propriedades catalíticas após eluição com aumento da força iônica em um gradiente de NaCl nas concentrações entre 0,2 e 0,5M. Para aprimorar o estudo, foi obtida uma α-manosidase recombinante em bactérias Escherichia coli da linhagem Rosetta transformada com o vetor pET15b clonado com o gene da α-manosidase vacuolar de P. brasiliensis, sendo padronizadas as condições de expressão. Determinou-se que a melhor condição para induzir a proteína recombinante nessas bactérias transformadas era em culturas com densidade óptica a 600nm de 0,7, à temperatura ambiente, por 30 horas, sob agitação constante. A proteína contendo uma etiqueta de seis histidina na região N-terminal foi purificada utilizando-se cromatografias de afinidade em coluna de níquel imobilizado e de troca iônica em coluna HiTrap Q XL pH 9,0, tendo os maiores valores de atividade enzimática relativa na eluição entre 0,2 e 0,5M de NaCl. A análise da proteína recombinante por cromatografia em coluna Superdex 200 revelou que a atividade enzimática é recuperada em uma massa molecular aparente de 128kDa. Essa atividade da enzima recombinante foi analisada após isolamento em cromatografias de afinidade em coluna de níquel imobilizado e de troca iônica, mostrando condições ótimas para hidrólise do substrato em pH 6,0 e temperatura de 45ºC, evidenciado uma alta estabilidade da enzima após incubação em temperatura ótima, e manutenção da catálise na ausência de cátions divalentes. Os ensaios de fagocitose realizados in vitro mostraram que macrófagos pré-tratados com a molécula recombinante apresentaram maiores taxas fagocíticas de P. brasiliensis em relação aos controles não tratados ou estimulados com albumina bovina, sugerindo que essa enzima pode ter um papel significativo na interação do fungo com o hospedeiro.
Title in English
Isolation of α-mannosidase from Paracoccidioides brasiliensis and determination of its role in the fungus-host relationship
Keywords in English
α-Mannosidase
Glycosidase
Glycosidic hydrolase
Paracoccidioides
Abstract in English
Paracoccidioides is a genus of fungi that causes paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis endemic in South American countries, including Brazil, which accounts for approximately 85% of PCM cases. These dimorphic fungi grow with a filamentous form (hypha) at environmental temperature and a yeast one at human body temperature. Yeasts are the pathogenic and resistance forms of Paracoccidioides, causing chronic inflammation, especially in the lungs. In preliminary studies, our group identified a vacuolar α-mannosidase from the supernatants of P. brasiliensis isolate Pb18 cultures. When we evaluated the differential expression of α-mannosidase messenger RNA by reverse transcription and polymerase chain reaction of three P. brasiliensis strains with different degrees of virulence, we detected higher gene expression in virulent strain yeasts than in less virulent or avirulent ones. Besides, virulent P. brasiliensis yeasts showed higher gene expression when compared with hyphae. These results suggest that there is a positive correlation between α-mannosidase gene expression and virulence of P. brasiliensis. In the present study, we initiated the process of purification of the α-mannosidase from the supernatant of the Pb18 yeast culture by an anion exchange chromatography on HiTap Q column at pH 8,0. The enzyme activity was detected in the bound proteins that were eluted in a constant gradient of ionic strength in concentrations between 0.2 and 0.5 M NaCl. The small amount of natural enzyme in culture supernatants motivate us to produce a recombinant α-mannosidase, which was obtained from Rosetta strain of Escherichia coli transformed with the vector pET15b cloned with the gene of the vacuolar α-mannosidase from P. brasiliensis. The best condition to induce the recombinant protein was obtained in transformed bacteria cultures with an optical density at 600nm of 0.7, at room temperature, for 30 hours, under constant agitation. The six-histidine-tagged recombinant protein was isolated by using affinity chromatography on an immobilized nickel affinity column, and ion-exchange chromatography on a HiTrap Q column, pH 9,0. Enzyme active material from affinity chromatography bound on a HiTrap Q column was eluted in concentrations between 0.2 and 0.5 M NaCl in a constant gradient of ionic strength, similarly to elution of natural protein from P. brasiliensis. Analysis of the recombinant protein by gel filtration chromatography on a Superdex 200 column revealed that the enzymatic activity is recovered at an apparent molecular mass of 128kDa. This activity of the recombinant enzyme was isolated sequentially on affinity and ion-exchange chromatography, showing optimal conditions for substrate hydrolysis at pH 6.0 and temperature of 45ºC. The recombinant enzyme had high stability after incubation at the optimal temperature, and it maintains catalysis in the absence of divalent cations. In vitro phagocytosis assays showed that macrophages pretreated with the recombinant molecule showed higher phagocytic rates of P. brasiliensis compared to controls untreated or stimulated with bovine albumin, suggesting that this enzyme may have a significant role in the fungus interaction with the host.
 
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Publishing Date
2021-06-18
 
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