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Doctoral Thesis
DOI
https://doi.org/10.11606/T.17.2022.tde-10042023-161658
Document
Author
Full name
Tamara Silva Rodrigues
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Ribeirão Preto, 2022
Supervisor
Committee
Zamboni, Dario Simões (President)
Leiria, Luiz Osório Silveira
Mansur, Daniel Santos
Viola, Patricia Torres Bozza
Title in Portuguese
Importância do inflamassoma no desenvolvimento das formas graves de COVID-19 em pacientes e em modelo experimental murino
Keywords in Portuguese
CASP11
CASP4
COVID-19
Inflamassoma
NLRP3
SARS-CoV-2
Abstract in Portuguese
Introdução: Casos graves de COVID-19 são caracterizados por um forte processo inflamatório que pode levar à falência de órgãos e morte do paciente. O inflamassoma de NLRP3 é uma plataforma molecular que promove a inflamação através da clivagem e da ativação das principais moléculas inflamatórias, incluindo caspase-1 ativa (Casp1p20), IL-1β e IL-18. A ativação do inflamassoma de NLRP3 pode ocorrer pela via canônica ou não canônica, quando há participação de caspase-4/CASP4 humana (caspase-11/CASP11 de camundongo). Objetivo: O objetivo deste trabalho foi investigar a ativação do inflamassoma e sua participação na fisiopatologia da COVID-19. Métodos e Resultados: Inicialmente, infectamos monócitos humanos primários in vitro com SARS-CoV-2 e avaliamos a ativação do inflamassoma. Observamos que a infecção por SARS-CoV-2 desencadeia a ativação da caspase-1, avaliada através do ensaio de luminescência, Caspase-Glo 1, e produção de IL-1β, quantificada por ELISA. Também observamos que o SARS-CoV-2 desencadeia a liberação de LDH em monócitos e requer a presença de SARS-CoV-2 viável. Em seguida, medimos a formação de "puncta" de NLRP3 e ASC e identificamos que o SARS-CoV-2 desencadeia a formação de "puncta" em um processo que também necessita de vírus viável. Posteriormente, infecções in vivo realizadas em camundongos transgênicos humanizados, K18-hACE2, deficientes ou não para CASP11, indicaram que camundongos hACE2 Casp11-/- foram protegidos quanto ao desenvolvimento da doença, com perda de peso corporal reduzida, variação de temperatura reduzida, área parenquimatosa pulmonar reduzida, escore clínico reduzido da doença e redução da mortalidade. Através do ensaio FAM-YVAD que permite a marcação de caspase-1 intracelular ativa, evidenciamos uma porcentagem maior de PBMCs FAM-YVAD+ em pacientes no dia zero de internação em comparação com os controles saudáveis. Além disso, a observação microscópica dessas células permitiu a visualização de "puncta" de NLRP3 e ASC em PBMCs, indicando que existem inflamassomas ativos em células de pacientes com COVID-19. Similarmente, encontramos o inflamassoma de NLRP3 ativo em tecidos de autópsia de pacientes post mortem através de ensaios de imuno-histoquímica e imunofluorescência. Vale salientar que os produtos derivados do inflamassoma, como Casp1p20 e IL-18 presentes nos soros dos pacientes, correlacionaram-se com os marcadores de gravidade de COVID-19, incluindo IL-6 e LDH. Os níveis mais elevados de IL-18 e Casp1p20 foram associados à gravidade da doença e pior evolução clínica. Avaliando amostras de casos letais de COVID-19, também evidenciamos a expressão gênica aumentada de CASP4 por RTPCR na nasofaringe e nos pulmões dos pacientes e esse resultado se correlacionou com a expressão de componentes do inflamassoma e mediadores inflamatórios, incluindo caspase-1 e IL-1β. Através do ensaio de western blotting, também observamos a ativação de CASP4 em PBMCs de pacientes com COVID-19 moderada e grave. Conclusão: Observamos que o SARS-CoV-2 induz a regulação positiva e a ativação da CASP4/CASP11 e esse processo contribui para a ativação do inflamassoma em resposta ao SARS-CoV-2. Nossos resultados sugerem que o inflamassomas participam da fisiopatologia da doença, indicando que essas plataformas podem ser um marcador de gravidade da doença e um potencial alvo terapêutico para COVID-19.
Title in English
Importance of the inflammasome in the development of forms severe cases of COVID-19 in patients and in an experimental model murine
Keywords in English
CASP11
CASP4
COVID-19
Inflammasome
NLRP3
SARS-CoV-2
Abstract in English
Introduction: Severe cases of COVID-19 are characterized by a strong inflammatory process that can lead to organ failure and patient death. The NLRP3 inflammasome is a molecular platform that promotes inflammation through the cleavage and activation of key inflammatory molecules, including active caspase-1 (Casp1p20), IL-1β and IL-18. Activation of the NLRP3 inflammasome can occur via canonical or non-canonical pathways, when human caspase-4/CASP4 (mouse caspase-11/CASP11) is involved. Aim: The aim of this work was to investigate the activation of the inflammasome and its participation in the pathophysiology of COVID-19. Methods and Results: Initially, we infected primary human monocytes in vitro with SARS-CoV-2 and evaluated inflammasome activation. We observed that SARS-CoV-2 infection triggers caspase-1 activation, assessed through the luminescence assay, Caspase-Glo 1, and IL-1β production, quantified by ELISA. We also observed that SARS-CoV-2 triggers LDH release in monocytes and requires the presence of viable SARS-CoV-2. We then measured NLRP3 and ASC "puncta" formation and identified that only the viable SARS-CoV-2 triggers puncta formation. Subsequently, in vivo infections performed in transgenic K18-hACE2 humanized mice, CASP11 deficient or not, indicated that hACE2 Casp11-/- mice were protected from the development of the disease, with reduced body weight loss, less temperature variation, diminished lung parenchymal area, lower clinical disease score, and reduced mortality. Through the FAM-YVAD assay, which allows the labeling of active intracellular caspase-1, we evidenced a higher percentage of FAM-YVAD+ PBMCs in patients on day zero of admission compared to healthy controls. Furthermore, microscopic observation of these cells allowed the visualization of puncta of NLRP3 and ASC in PBMCs, indicating that there are active inflammasomes in cells from patients with COVID-19. Studying moderate and severe COVID-19 patients, we performed immunohistochemistry and immunofluorescence assays and found active NLRP3 inflammasome in PBMCs and in postmortem autopsies of fatal patients. Of note, inflammasome-derived products such as Casp1p20 and IL-18 present in patient sera correlated with markers of COVID- 19 severity, including IL-6 and LDH. Higher levels of IL-18 and Casp1p20 were associated with disease severity and worse clinical outcome. Evaluating samples from lethal COVID-19 cases, we also evidenced increased CASP4 gene expression by RT-PCR in nasopharyngeal swabs and lungs of patients, and this result correlated with the expression of inflammasome components and inflammatory mediators, including caspase-1 and IL-1β. Through western blotting assay, we also observed CASP4 activation in PBMCs from patients with moderate and severe COVID-19. Conclusion: We observed that SARS-CoV-2 induces the upregulation and activation of CASP4/CASP11 and this process contributes to inflammasome activation in response to SARS-CoV-2. Our results suggest that inflammasomes participate in the pathophysiology of the disease, indicating that these platforms can be a marker of disease severity and a potential therapeutic target for COVID-19.
 
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Publishing Date
2023-04-13
 
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