• JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
 
  Bookmark and Share
 
 
Doctoral Thesis
DOI
https://doi.org/10.11606/T.17.2022.tde-08082022-084905
Document
Author
Full name
Leonardo Lima dos Santos
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Ribeirão Preto, 2021
Supervisor
Committee
Zamboni, Dario Simões (President)
Borges, Valéria de Matos
Bortoluci, Karina Ramalho
Câmara, Niels Olsen Saraiva
Title in Portuguese
Leishmania amazonensis induz ativação do inflamassoma de AIM2 em macrófagos via estresse do retículo endoplasmático e DNA mitocondrial
Keywords in Portuguese
DNA mitocondrial
Estresse do retículo endoplasmático
Imunidade inata
Inflamassoma
Leishmania
Abstract in Portuguese
O retículo endoplasmático é uma organela envolvida em processos de síntese lipídica, tradução e processamento proteico. Em homeostasia, ela promove o enovelamento apropriado de proteínas para que elas possam desempenhar suas funções fisiológicas. No entanto, em condições de falta de nutrientes, hipóxia, mutações proteicas, altos níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS), desbalanço nos níveis de cálcio intra-reticular e infecções, podem levar ao acúmulo de proteínas mal enoveladas no lúmen do RE e conseguinte indução das vias efetoras do estresse de retículo endoplasmático (ERE). Dentre várias consequências da ativação de ERE, estão a produção de citocinas pro- inflamatórias, indução de dano mitocondrial e ativação do inflamassoma. Já foi descrito na literatura a relação entre a indução de ERE e a ativação do inflamassoma de NLRP3. No entanto, apesar de ser descrito na literatura que durante a ativação de ERE ocorre liberação de DNA mitocondrial, não há relatos da conexão entre ERE, liberação de DNA mitocondrial (DNAmt) no citosol e ativação de AIM2. Desta forma, nós hipotetizamos que a ativação do inflamassoma pela indução por ERE seria mediada pelo reconhecimento do DNA mitocondrial pelo inflamassoma de AIM2. Para testar esta hipótese, nós utilizamos modelos farmacológicos de ativação de ERE - Tapsigargina (TG) e Tunicamicina (TM) - assim como um modelo de ativação de ERE e do inflamassoma que é o parasito L. amazonensis. Uma análise inicial demonstrou que BMDMs tratados com TG e TM levam a secreção de IL-1β, clivagem de caspase-1 e formação de punctas de ASC de forma dependente de AIM2. Além disso, nós demonstramos que a ativação do inflamassoma de AIM2 também ocorre durante a infecção por espécies de Leishmania, em BMDMs, BMDCs, é independente de microbiota, dependente de MOI, de tempo de infecção e espécie-específica. Finalmente, nós observamos que a secreção de IL-1β induzida por Leishmania amazonensis é reduzida com inibição de ERE, assim como na deficiência para AIM2, e que em BMDMs Aim2-/- a inibição de ERE não promove alterações nos níveis de IL-1β, sugerindo que estes mecanismos operam na mesma via. Estes dados corroboram a primeira parte da nossa hipótese, na qual ERE leva a ativação do inflamassoma de AIM2. Em seguida, utilizando um modelo de relevância biológica com infecção in vitro de L. amazonensis em BMDMS, nós corroboramos a hipótese de que ERE poderia levar a ativação de AIM2 e esta via seria importante para o controle da infecção in vitro. Para testar a segunda parte da hipótese, na qual a ativação do inflamassoma de AIM2, por ERE, seria mediada pelo DNAmt, nós utilizamos um modelo de depleção de DNAmt em BMDMs. Este modelo é funcional, uma vez que as células mantêm a viabilidade celular e potencial de membrana mitocondrial intactos durante os experimentos. Inicialmente, observamos que L. amazonensis, assim como TG e TM promovem alteração no potencial da membrana mitocondrial de forma dependente de ERE e independente de AIM2, sugerindo que o sensor de DNA estaria downstream de ERE e do dano mitocondrial. Comparando células depletadas, ou não, para o DNA mitocondrial, observamos, que a secreção de IL-1B induzida por TG, TM ou L. amazonensis, e o controle da infecção deste parasito são reduzidos no background WT mas não no Aim2-/-, sugerindo que estas moléculas também operam na mesma via. Em conjunto, os dados deste trabalho suportam a hipótese de que a indução de ERE leva a uma ativação de AIM2 mediada por dano mitocondrial e DNAmt, e que esta via é biologicamente relevante para o controle intracelular de um patógeno.
Title in English
Leishmania amazonensis induces AIM2 inflammasome activation in macrophages via endoplasmic reticulum stress and mitochondrial DNA
Keywords in English
Endoplasmic reticulum stress
Inflammasome
Innate immunity
Leishmania
Mitochondrial DNA
Abstract in English
The endoplasmic reticulum is an organelle involved in processes of lipid synthesis, translation and protein processing. In homeostasis, it promotes the proper folding of proteins to allow them to perform their physiological functions. However, lack of nutrients, hypoxia, protein mutations, high levels of reactive oxygen species (ROS), intra-reticular calcium level imbalance and infections, can lead to the accumulation of misfolded proteins in the ER lumen and consequent induction of endoplasmic reticulum stress (ERS) effector pathways. Among several consequences of ERS activation are the production of proinflammatory cytokines, induction of mitochondrial damage and inflammasome activation. The relationship between ERS induction and NLRP3 inflammasome activation has already been described in the literature. However, despite being reported that mitochondrial DNA release occurs during ERS activation, there is no data showing the connection between ERS, mitochondrial DNA (mtDNA) release in the cytosol and AIM2 activation. Thus, we hypothesized that inflammasome activation by ERS induction would be mediated through the recognition of mitochondrial DNA by the AIM2 inflammasome. To test this hypothesis, we used pharmacological models of ERS activation - Thapsigargin (TG) and Tunicamycin (TM) - as well as a model of ERS and inflammasome activation that is the parasite L. amazonensis. An initial analysis demonstrated that TG and TM-treated BMDMs lead to IL-1 secretion, caspase-1 cleavage and ASC puncta formation in an AIM2- dependent manner. Furthermore, we demonstrated that AIM2 inflammasome activation also occurs during Leishmania spp. infection, in BMDMs, BMDCs, it is microbiota-independent, MOI, time-dependent, and species-specific. Finally, we observed that Leishmania amazonensis-induced IL-1 secretion is reduced in the context of ERS inhibition, as well as in AIM2 deficiency and that in Aim2/ BMDMs ERS inhibition does not promote changes in IL-1 levels, suggesting that these mechanisms operate in the same pathway. These data support the first part of our hypothesis, in which ERS leads to AIM2 inflammasome activation. Then, using a biologically relevant model of L. amazonensis in vitro infection in BMDMS, we supported the hypothesis that ERS could lead to AIM2 activation and this pathway would be important for in vitro infection control. To test the second part of the hypothesis, in which ERS induces the activation of AIM2 inflammasome would be mediated by mtDNA, we used a model of mtDNA depletion in BMDMs. This model is functional, once the cells maintain cell viability and mitochondrial membrane potential intact during the experiments. Initially, we observed that L. amazonensis, as well as TG and TM, promote changes in mitochondrial membrane potential in an ERSdependent and AIM2-independent manner. Suggesting that the DNA sensor would be downstream of ERE and mitochondrial damage. Comparing cells depleted or not for mitochondrial DNA, we observed that the secretion of IL-1B induced by TG, TM or L. amazonensis, and the control of the infection of this parasite are reduced in the WT background but not in the Aim2/, suggesting that these molecules also operate in the same pathway. Taken together, the data from this work support the hypothesis that ERS induction leads to an activation of AIM2 mediated by mitochondrial damage and mtDNA and that this pathway is biologically relevant for the intracellular control of a pathogen.
 
WARNING - Viewing this document is conditioned on your acceptance of the following terms of use:
This document is only for private use for research and teaching activities. Reproduction for commercial use is forbidden. This rights cover the whole data about this document as well as its contents. Any uses or copies of this document in whole or in part must include the author's name.
Publishing Date
2022-08-16
 
WARNING: Learn what derived works are clicking here.
All rights of the thesis/dissertation are from the authors
CeTI-SC/STI
Digital Library of Theses and Dissertations of USP. Copyright © 2001-2023. All rights reserved.