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Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/T.17.2020.tde-08012020-111240
Documento
Autor
Nome completo
Renan Villanova Homem de Carvalho
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2019
Orientador
Banca examinadora
Zamboni, Dario Simões (Presidente)
Alves Filho, José Carlos Farias
Bargieri, Daniel Youssef
Bozza, Marcelo Torres
Título em português
O papel do vírus de RNA de Leishmania na modulação da resposta imune inata
Palavras-chave em português
Autofagia
Imunidade inata
Inflamassoma
Leishmaniose
LRV
Virulência
Resumo em português
Parasitos do gênero Leishmania são os agentes causadores da Leishmaniose, uma importante doença que acomete humanos. Estima-se que mais de 12 milhões de pessoas em todo o mundo estejam infectadas, e que 350 milhões estejam em risco de contrair a doença. A forma mais branda da doença, denominada Leishmaniose cutânea, pode em alguns casos evoluir para uma forma mais grave e devastadora, onde parasitos podem metastizar e atingir os tecidos da naso-faringe, gerando a doença mucocutânea. Para que o fenômeno da metastização aconteça, os parasitos precisam subverter diversas funções do hospedeiro, para que possam se replicar e espalhar eficientemente. Leishmania braziliensis e Leishmania guyanensis são espécies que se encontram variavelmente infectadas pelo vírus de RNA de Leishmania (do inglês LRV), e sua presença correlaciona-se com a forma mais grave da doença. Porém, os mecanismos pelos quais o vírus agrava a Leishmaniose ainda permanecem pouco estudados. O principal tipo celular em que os parasitos replicam é o macrófago, onde modulam diversas vias de sinalização, incluindo aquelas envolvidas na ativação da imunidade inata. Dentre estas, destaca-se o sensor citosólico NLRP3, o qual foi recentemente demonstrado ter papel fundamental no desenvolvimento da infecção por Leishmania. Este sensor de dano celular é capaz de se oligomerizar e ativar uma plataforma citoplasmática denominada inflamassoma, composta por NLRP3, ASC e Caspase-1, que por sua vez pode ser ativada pela via canônica, por meio da geração de espécies reativas de oxigênio e efluxo de K+, principalmente. Por outro lado, a via não-canônica de ativação de NLRP3 acontece pelo reconhecimento de lipopolissacarídeo bacteriano no citoplasma, o qual ativa a enzima caspase-11. Entretanto, ainda não se sabe o papel de caspase-11 no reconhecimento de parasitos, como Leishmania. No presente estudo, nós avaliamos o possível papel do LRV na modulação de receptores da imunidade inata, focando principalmente no NLRP3. Através da análise de aspirados de lesões obtidos de pacientes com Leishmaniose cutânea ou muco-cutânea, observamos que a presença do LRV correlaciona-se com uma maior probabilidade de desenvolvimento da forma mais agressiva da doença, assim como uma menor ativação de moléculas inflamassoma-dependentes, como caspase-1 e IL-1?, sugerindo que o LRV possa interferir na ativação de NLRP3 pelo parasito. Para melhor investigar esta hipótese, geramos um clone LRV negativo a partir da cepa M4147 de Leishmania guyanensis, a qual possui alta carga de LRV. Utilizando uma combinação de experimentos realizados em macrófagos murinos e humanos, descobrimos que o LRV, encontrado dentro de vesículas extracelulares (do inglês, EVs) secretadas pelo parasito, é capaz de se ligar ao receptor TLR3 via sua dupla fita de RNA, o qual recruta TRIF e induz a produção de IFN tipo I. Este, por sua vez, é capaz de ativar células de forma parácrina ou autócrina para induzir a autofagia, que por sua vez degrada componentes do inflamassoma localizados no citoplasma, como NLRP3 e ASC, favorecendo a replicação do parasito in vitro e in vivo. Mais além, demonstramos que o LRV é capaz de inibir a ativação da via não-canônica de NLRP3, interferindo com a ativação de caspase-11 efetuada pelo parasito. Desta forma, sugerimos um mecanismo de evasão desencadeado pelo LRV no contexto da infeção por Leishmania, que favorece o crescimento do parasito e o agravamento da doença, indicando vários alvos moleculares para o tratamento e prevenção da devastadora forma mucocutânea da Leishmaniose.
Título em inglês
The role of Leishmania RNA vírus in the modulation of the innate imune response
Palavras-chave em inglês
Autophagy
Inflammasome
Innate immunity
Leishmaniasis
LRV
Virulence
Resumo em inglês
Parasites from Leishmania genus are the causative agents of Leishmaniasis, an important human disease. It is estimated that over 12 million people are infected worldwide, and 350 million are under risk of acquiring the disease. The cutaneous form is the mildest type of the disease, which may evolve to a devastating outcome, named mucocutaneous leishmaniasis, in where parasites may methastize and reach nasopharingeal tissues. In order to do so, parasites must subvert several imune functions displayed by the host to efficiently establish their replication and dissemination. Leishmania braziliensis and Leishmania guyanensis are some species that may be found variably infected by the Leishmania RNA virus (LRV) in nature, and its presence has been associated with the development of mucocutaneous disease in patients. However, the mechanisms by which LRV enhances disease severity remain largely unknown. Macrophages are the main cell type in which the parasites replicate, where they negatively modulate several innate immune signaling pathways. Among them, we highlight the cytosolic sensor NLRP3, which has recently been shown to be play an important role in parasite control. This sensor is able to sense cellular damage and oligomerize to form a cytoplasmic platform known as the inflammasome, composed by NLRP3, ASC (the adaptor molecule) and Caspase-1. NLRP3 may be activated via the canonical pathway, through reactive oxygen species and potassium efflux, or via the non-canonical pathway, which happens via cytosolic detection of bacterial LPS via caspase- 11. In the latter case, the role of caspase-11 in the detection of parasitic infections, such as Leishmania, is still unknown. In the current study, we evaluated the possible role of LRV in the modulation of the innate immune response, with special focus given to NLRP3. By analyzing lesion aspirates obtained from patients displaying either cutaneous or mucocutaneous disease, we observed a positive correlation between the presence of LRV and the likelihood of developing the most severe form of the disease, while virus presence correlated with decreased activation of the inflammasome, suggesting that LRV could interfere with NLRP3 activation by the parasite. To better investigate this hypothesis, we generated a LRV negative clone by the M4147 L. guyanensis strain, which harbors high levels of the virus. Through a combination of experiments performed both in mouse and human macrophages, we found that LRV is found within extracelular vesicles secreted by the parasite, which binds to TLR3 via its double-stranded RNA, recruiting TRIF and driving type I IFN production. This cytokine induces autophagy in an autocrine or paracrine manner, which degrades NLRP3 and ASC in the cytoplasm, then favouring parasite replication in vitro and in vivo. Moreover, we show that LRV is capable of blocking caspase-11 and the noncanonical pathway induced by the parasites. Taken together, our results demonstrate an evasion mechanism triggered by LRV in the context of Leishmania infection, favouring parasite replication and the severity of the disease. This work unravels several molecular targets with potential for pharmacological intervention, aiming the treatment and prevention of the devastating disease displayed by people suffering from mucocutaneous Leishmaniasis.
 
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Data de Publicação
2020-04-28
 
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