No gênero Flavivirus, da família Flaviviridae inclui-se um importante grupo de vírus transmitidos por artrópodes que é responsável por considerável morbidade e mortalidade, como nos casos do dengue e da febre amarela. Onze Flavivirus circulam no Brasil. Os Flavivirus são envelopados, possuem nucleocapsídeo contendo genoma RNA de fita simples e polaridade positiva com aproximadamente 11000 nucleotídeos. O genoma inclui uma pequena região 5' não-codificadora, uma cadeia aberta de leitura (ORF) e um terminal 3' não-codificador. A ORF codifica 3 proteínas estruturais C, preM, E e 7 proteínas não-estruturais NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5. A proteína não-estrutural 5 (NS5) é a maior (2700 nucleotídeos) e mais conservada proteína dos Flavivirus e acredita-se que possua função de RNA-polimerase RNA-dependente. Foi tema de nosso estudo a sequência nucleotídica do gene NS5 de 15 estirpes de Flavivirus brasileiros, Bussuquara, Cacipacoré, dengue tipos 1 (2 estirpes), 2 (3 estirpes) e 4, Iguape, Ilhéus, Rocio, encefalite de Saint Louis (2 estirpes) e febre amarela (estirpe selvagem e vacinai). Primeiramente, desenvolvemos metodologia de RT-PCR com primers (FG1/FU1RC) amplificadores de 723 nucleotídeos no centro do gene NS5, que se mostrou específica para vírus do gênero porque detectou genoma dos 15 vírus estudados. Também, desenvolvemos nested-PCR com primers (NES A/NES B) internos aos amplicons da RT-PCR, que se mostrou sensível e adequada à confirmação da origem viral dos produtos amplificados. Esta RT-nesfed-PCR possui utilidade como método diagnóstico rápido de infecções por Flavivirus. Em seguida, utilizando sequência de 600 nucleotídeos oriunda dos amplicons da RT-PCR e de seus aminoácidos inferidos, efetuamos estudo filogenético. Árvores filogenéticas criadas pelos métodos neighbor-joining e parcimônia mostraram os Flavivirus brasileiros agrupados em três ramos: ramo do vírus da febre amarela, ramo dos vírus do dengue com sub-ramos para os tipos 1, 2 e 4, e o ramo denominado Encefalite japonesa, que inclui os vírus da encefalite de Saint Louis, Cacipacoré, Iguape, Rocio, Ilhéus e Bussuquara. Os vírus transmitidos por mosquitos Aedes, como dengue e febre amarela, e que também são os únicos Flavivirus causadores de febres hemorrágicas no Brasil mostraram-se agrupados no mesmo ramo. Os vírus transmitidos por mosquitos Culex e que são causadores de encefalite como Rocio, Ilhéus, SLE, Cacipacoré, Bussuquara e Iguape foram agrupados no da Encefalite japonesa. Finalmente, fizemos análise funcional da NS5 de 5 dos Flavivirus estudados observando que a região dos aminoácidos 250 a 900, apresentava alta homologia com RNA-polimerase RNA-dependente de diversos Flaviviridae. Nas sequências nucleotídicas foi possível identificar os motifs A (DTKAWD), B (SGQPDTSAGN), C (GDD) e D (EAGK). O encontro destes motifs característicos sugere fortemente que a NS5 dos Flavivirus possua função RNA-polimerase RNA-dependente.

The Flavivirus genera of the Flavivirídae family, which are arboviruses, are among the most important agents of inffectious disease in Brazil, causing human infections with a high morbility and mortality. Presently, 11 flaviviruses are known circulating in Brazil: BUS, CPC, DEN1, DEN2, DEN3, DEN4, IGU, ILH, ROC, SLE, and YF. Flavivirus enveloped particles including the nucleocapsid containing an about 11,000 nucleotides single-stranded, positive-sense RNA. The genome is composed of a short 5' noncoding region, a single open reading frame (ORF), and a 3' non-coding terminus. The long ORF encodes 3 structural proteins, of the viral capsid (C), pre-membrane (preM), and envelope (E), and 7 nonstructural proteins NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5. The last protein encoded in the ORF is the non structural 5 protein (NS5). NS5 is the largest (2700 nucleotides) and the most highly conserved Flavivirus protein. It is assumed to be the Flavivirus RNA-dependent RNA polymerase (RdRp). NS5 is a key enzyme for the viral RNA replication. PCR offers several advantages over classical techniques for detecting flaviviruses. PCR is highly sensitive and rapid. Rapid detection by PCR should simplify and accelerate the diagnosis of infections with flaviviruses. In this study, Brazilian Flavivirus can be detected by nested-PCR based on conserved NS5 protein. In this work, by using a combination of quantitative definitions (bootstrap support level and the pairwise nucleotide sequence identity), we undertook a comprehensive phylogenetic study to establish the genetic relationship among the Brazilian viruses of the genus Flavivirus. The phylogeny of 15 virus amplicon sequence that were obtained by RT-PCR with primers for mosquito-borne Flavivirus were studied. The amplicons included a region of the Flavivirus genome of 723 nucleotides of the NS5 gene. Our phylogenetic study revealed that Brazilian Flavivirus were grouped into three main branches, including a yellow fever branch, a dengue branch that its turn is subdivided into serotypes 1, 2 and 4 branches, Japanese Encephalitis Virus Complex branch including SLE, Cacipacoré, Iguape, Rocio and Bussuquara viruses. Viruses transmitted by Aedes mosquitoes, such as dengue and yellow fever, that are also the only Flavivirus causing hemorrhagic fevers in Brazil, were grouped in the same cluster. Viruses transmitted by Culex mosquitoes and causing encephalitis as Rocio, Ilhéus, SLE, Cacipacoré, Bussuquara and Iguape were grouped in the Japanese encephalitis complex.