Os osteoclastos são as únicas células que desempenham a função de reabsorção óssea. Esta função demanda alta carga energética, por isso acredita-se que a proteína AMPK, um sensor energético expresso em osteoclastos, participa da reconfiguração metabólica que ocorre durante os processos de diferenciação e de ativação celular. A ativação de AMPK ocorre quando há um aumento da razão entre AMP/ATP no citoplasma. A AMPK é um complexo proteico heterotrimérico de serina/treonina quinase composta por três subunidades α, β e γ e, de acordo com suas combinações, dão origem a AMPKα1 e AMPKα2, sendo que AMPKα1 tem maior expressão do que AMPKα2 no tecido ósseo. Portanto, o objetivo desse trabalho é avaliar o mecanismo pelo qual a AMPKα1 estimula a osteoclastogênese in vitro e a sua participação na perda óssea in vivo. Para isso, utilizamos animais LysMcre/0AMPKα1f/f, e seus respectivos controles LysMcre/0para avaliar como a AMPKα1 interfere na osteoclastogênese e na atividade de reabsorção óssea in vitro. Foi avaliado ainda o efeito da depleção de AMPKα1 em osteoclastos (Ctskcre/0AMPKα1f/f) em animais saudáveis e em modelo experimental de osteoporose. Nossos dados mostraram que a expressão proteica de AMPKα1 e da sua forma ativa (pAMPKα1) está aumentada no tempo de 24h e que gradativamente é reduzida nos tempos de 48 e 72h após estímulo com RANKL. A depleção de AMPKα1 aumenta a expressão gênica de marcadores de diferenciação e fusão de osteoclastos como Nfatc1, Itgb3 e Dcstamp. Além disso, as células LysMcre/0AMPKα1f/f diferenciaram em células com um maior número e tamanho, assim como levou a maior fusão e multinucleação dos osteoclastos. A ausência de AMPKα1 aumenta ainda a área do anel de actina, o que sugere uma maior adesão à matriz extracelular. Como esperado, AMPKα1 regula negativamente a reabsorção óssea in vitro, pois a expressão de Ctsk e Mmp9, bem como a taxa de reabsorção óssea está aumentada em osteoclastos LysMcre/0AMPKα1f/f. Nossos dados demonstraram ainda, que AMPKα1 regula os marcadores de fusão mitocondrial Mnf1 e Mnf2, além de verificar que as células LysMcre/0AMPKα1f/f apresentaram maior área mitocondrial. Em estudo in vivo, a análise de fêmures dos animais Ctskcre/0AMPKα1f/f apresentaram piores parâmetros ósseos quando comparado com o controle, confirmando uma perda óssea associada com o aumento de células TRAP positivas por histologia. Ainda foi observado que nos animais Ctskcre/0AMPKα1f/f ovariectomizados a perda óssea não foi exacerbada comparados com o grupo controle SHAM. Nossos dados sugerem que a deficiência seletiva de AMPKα1 levou a uma maior formação e atividade dos osteoclastos, bem como uma maior perda óssea in vitro e in vivo. Portanto, nossos dados evidenciam que a AMPKα1 seja um regulador negativo da osteoclastogênese, da fusão celular e da atividade dos osteoclastos. Além disso, a deleção de AMPKα1 aumeta a perda óssea e o desenvolvimento da osteoporose espontânea.

Osteoclasts are the only cells that perform the bone resorption. This function demands a high energy load, so it is believed that AMPK protein, an energy sensor expressed in osteoclasts, participates in the metabolic reconfiguration that occurs during the processes of cell differentiation and activation.The activation of AMPK occurs when there is an increase in the ratio of AMP/ATP in the cytoplasm. AMPK is a heterotrimeric serine/threonine kinase protein complex composed of three subunits α, β and γ and, according to their combinations, form AMPKα1 and AMPKα2, and AMPKα1 is highly expressed than AMPKα2 in bone. Therefore, the aim of this work is to evaluate the mechanism by which AMPKα1 stimulates osteoclastogenesis in vitro and its participation in bone loss in vivo. Therefore, we used LysMcre/0AMPKα1f/f animals, and their respective LysMcre/0 controls to evaluate how AMPKα1 interferes with osteoclastogenesis and bone resorption activity in vitro. The effect of AMPKα1 depletion on osteoclasts (Ctskcre/0AMPKα1f/f) in healthy animals and in an experimental osteoporosis model was also evaluated. Our data showed that protein expression of AMPKα1 and its active form (pAMPKα1) reaches its peak in 24 hours, and that it is gradually reduced at 48 to 72 hour-period after stimulation with RANKL. Depletion of AMPKα1 increases gene expression of osteoclast differentiation and fusion markers such as Nfatc1, Itgb3, Dcstamp. In addition, LysMcre/0AMPKα1f/f osteoclasts showed a greater number and size, as well as greater fusion and multinucleation process. The absence of AMPKα1 further increased the area of the actin ring, suggesting greater adhesion to the extracellular matrix. As expected, AMPKα1 negatively regulates bone resorption in vitro, as the expression of Ctsk and Mmp9 and the rate of bone resorption is increased in LysMcre/0AMPKα1f/f osteoclasts. Our data further demonstrated, that AMPKα1 regulates mitochondrial fusion markers Mnf1 and Mnf2, and that LysMcre/0AMPKα1f/f osteoclasts showed greater mitochondrial area. As for the in vivo study, femurs from Ctskcre/0AMPKα1f/f animals showed lower bone parameters, confirming a bone loss associated with the increase of TRAP positive cells evaluated in histology sections. It was also observed that in the Ctskcre/0AMPKα1f/f ovariectomized animals, the bone loss was not exacerbated compared to the SHAM control group. Our data suggest that selective AMPKα1 deficiency led to increased osteoclast formation and activity, as well as greater bone loss in vitro and in vivo. Therefore, this study show evideces that AMPKα1 is a negative regulator of osteoclastogenesis, cell fusion, and osteoclast activity. In addition, deletion of AMPKα1 induce bone loss and spontaneous development of osteoporosis.