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Mémoire de Maîtrise
DOI
https://doi.org/10.11606/D.17.2020.tde-23082020-110105
Document
Auteur
Nom complet
Eduardo Domingos Borges
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
Ribeirão Preto, 2020
Directeur
Jury
Navarro, Paula Andrea de Albuquerque Salles (Président)
Molina, Carlos Augusto Fernandes
Reis, Rosana Maria dos
Vireque, Alessandra Aparecida
Titre en portugais
Aplicação do método de monitoramento de reações múltiplas (MRM-profiling) para a caracterização lipídica de espermatozoides de homens férteis e subférteis
Mots-clés en portugais
Espectrometria de massas
Espermatozoide humano
Fertilidade masculina
Lipidômica
MRM-profiling
Resumé en portugais
Os lipídios espermáticos são fundamentais para a integridade do sistema de membranas e determinam muitas de suas importantes propriedades físico-químicas que, por sua vez, estão intimamente relacionadas com a capacidade de fertilização. Apesar de sua clara importância, os dados disponíveis sobre o perfil lipídico das células espermáticas humanas são limitados. As técnicas de espectrometria de massas mais comumente utilizadas para obter esses dados têm resultados informativos, porém amplamente dominados por sinais de fosfatidilcolina (PC) e liso-fosfatidilcolina (LPC) que impedem a detecção de outras classes lipídicas. Sendo assim, o principal objetivo deste estudo foi implementar o método de MRM-profiling utilizando um equipamento de espectrometria de massas com ionização por electrospray (ESI-MS) para a análise de células espermáticas de homens férteis e subférteis possibilitando a detecção simultânea de diversas classes lipídicas de interesse. Além disso, objetivou-se comparar os valores observados nos dois grupos a fim de identificar espécies lipídicas diretamente relacionadas à fertilidade masculina. Foi realizado um estudo prospectivo observacional onde extratos lipídicos de amostras seminais de 10 homens férteis e 10 homens subférteis foram analisados utilizando técnica e método previamente mencionados. Os lipídios foram extraídos usando o protocolo de Bligh & Dyer adaptado para espermatozoides e armazenados a -80 ºC até a data de envio para análise. O envio foi feito via correio aéreo internacional em temperatura ambiente após selagem a vácuo. Uma análise inicial confirmou a eficiência do processo de extração e o transporte das amostras seladas à vácuo, em temperatura ambiente. A primeira etapa do método de MRM-profiling detectou a presença de 417 espécies lipídicas nas amostras (a partir de uma seleção inicial de 1287 feita em bases de dados). A análise estatística dos dados obtidos na segunda etapa identificou 162 lipídios diferencialmente expressos entre os dois grupos (utilizando o volcano plot com fold change = 1.5; valor de p = 0,05). Além disso, a análise hierárquica aglomerativa por cluster indicou uma clara separação entre os grupos em relação a abundância de determinadas classes lipídicas. O estudo mostrou que ESI-MS associada ao método de MRM-profiling é uma abordagem bastante adequada para investigar a lipidômica de células espermáticas pois permitiu a avaliação do perfil lipídico dos espermatozoides humanos de maneira rápida e sensível, utilizando quantidades mínimas de amostra. As diferenças observadas entre os dois grupos são consistentes com a literatura, no entanto, serão necessários mais estudos para detectar possíveis biomarcadores para a fertilidade masculina. A lista de 417 lipídios detectados neste estudo tem grande valor na caracterização lipídica do espermatozoide humano e poderá servir como base para estudos futuros.
Titre en anglais
Applying Multiple Reaction Monitoring (MRM) - profile to characterize the lipid contents of spermatozoa from fertile and subfertile men
Mots-clés en anglais
Human sperm
Lipidomics
Male fertility
Mass spectrometry
MRM-profiling
Resumé en anglais
Sperm lipids are essential to the integrity of the membrane system and determine many of its important physicochemical properties, which, in turn, are closely related to the capacity for fertilization. Despite its undeniable relevance, the available data on the lipid profile of human sperm cells are limited. Mass spectrometry techniques most commonly used to obtain these data are largely dominated by phosphatidylcholine (PC) and lysophosphatidylcholine (LPC) signals that prevent the detection of other lipid classes. Thus, the main objective of this study was to implement the MRM-profiling method using electrospray ionization mass spectrometry equipment (ESI-MS) for the analysis of sperm cells from fertile and subfertile men, enabling the simultaneous detection of several classes lipids of interest. In addition, the work aimed to compare the values observed in the two groups in order to identify lipid species directly related to male fertility. A prospective observational study was carried where lipid extracts from seminal samples of 10 fertile men and 10 subfertile men were analyzed using the previously mentioned technique and method. Lipids were extracted using the Bligh & Dyer protocol adapted for sperm cells and stored at -80 ºC until the date of analysis. Shipment was made via international airmail at room temperature after vacuum sealing. An initial analysis confirmed the efficiency of the extraction protocol as well as the handling of samples. The first stage of the MRM-profiling detected the presence of 417 lipid species in the samples (from an initial manual selection of 1287). The statistical analysis of the data obtained in the second step identified 162 different lipids between the two groups (using the volcano plot with fold change = 1.5; p value = 0.05). In addition, the cluster agglomerative hierarchical analysis indicated a clear separation between the groups in relation to certain lipid classes. The study showed that ESI-MS associated with MRM-profiling is an optimal approach to investigate the lipidomics of sperm cells, as it allowed the evaluation of the lipid profile of human sperm in a quick and sensitive way, using minimal sample quantities. The differences observed between the two groups are consistent with previous works; however, further studies are needed to single out possible biomarkers for male fertility. The list of 417 lipids detected in this study has great value in the lipid characterization of human sperm and could serve as a basis for future studies.
 
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Date de Publication
2020-10-19
 
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