Pacientes Oncológicas do sexo feminino, principalmente meninas pré-púberes e mulheres inaptas à estimulação ovariana, quando são submetidas à quimioterapia enfrentam a possibilidade de perder sua fertilidade devido à gonadotoxidade destas drogas. A criopreservação de tecido ovariano, seguida do cultivo de folículos ovarianos in vitro em sistema multistep, apesar de ainda experimental, parece ser a estratégia mais promissora para a obtenção de oócitos MII competentes, para futura utilização em técnicas de FIV. A ativação de folículos primordiais no tecido ovariano e seu crescimento aos estágios primário e secundário é o passo mais desafiador para a consolidação deste sistema uma vez que, em condições fisiológicas, esse processo leva meses nos mamíferos superiores. O processo de ativação dos folículos primordiais inativos do pool é um evento fisiológico ainda pouco elucidado, por isso a ativação folicular artificial é um grande desafio. A via de sinalização PI3K parece estar diretamente envolvida na ativação de folículos ovarianos primordiais. O uso de inibidores do PTEN, um regulador negativo fundamental da PI3K, parece promover ativação destes folículos in vitro, no entanto, com sucesso modesto com a continuação do crescimento e desenvolvimento, principalmente devido a impactos importantes na estrutura folicular e do estroma tecidual. Nosso estudo teve como objetivo expor o tecido do córtex ovariano bovino ao bpV(pic), um inibidor de PTEN em diferentes condições e avaliar seus efeitos nos folículos e no estroma ovariano. Fragmentos ovarianos foram cultivados com bpV(pic) a 1, 10 ou 100µM por 12, 24 e 48h (9 grupos tratados) e mantidos em cultivo até completar 7 dias. Um controle fresco e um controle cultivado foram comparados aos grupos tratados quanto ao (a) desenvolvimento folicular, através de classificação histomorfométrica, (b) ativação de PI3K, indicada pela extrusão nuclear do fator de transcrição Foxo3 pelo ensaio IHC, (c) apoptose folicular e (d) do estroma, por IHC de caspase-3 clivada e (e) quantificação de espessura de fibras colágenas por coloração de picrosírius red observada sob microscopia de luz polarizada. Nossos achados não mostraram diferença significativa na ativação da via PI3K ou na alteração das taxas de desenvolvimento folicular, no entanto, doses elevadas de bpV(pic) mostraram-se prejudiciais à sobrevivência folicular. Quando comparados ao controle cultivado, os fragmentos tratados com 100µM apresentaram até o dobro das taxas de apoptose nas células do estroma. O uso de doses intermediárias (10µM) do fármaco mostrou um efeito protetor às células do estroma. O ensaio de picrosirius red mostrou influência significativa da exposição prolongada, com importante redução da espessura das fibras colágenas, indicando desgaste na matriz extracelular em resposta ao fármaco. Há um efeito dose-dependente da exposição ao bpV (pic) na vitalidade folicular e no dano do estroma. Considerando uma possível atividade protetora tecidual em condições intermediárias de exposição ao inibidor de PTEN, a utilização desta molécula associada a outros ativadores de PI3K pode ser uma abordagem interessante para a concepção de uma primeira fase do sistema de cultivo multistep.

Female oncopatients, especially pre-pubertal girls and women unsuitable for ovarian stimulation, when undergoing chemotherapy face the possibility of losing their fertility due to the gonadotoxicity of these drugs. Cryopreservation of ovarian tissue, followed by the cultivation of ovarian follicles in vitro in a multistep system, although still experimental, appears to be the most promising strategy for obtaining competent MII oocytes for future use in IVF techniques. The activation of primordial follicles in the ovarian tissue and their growth to the primary and secondary stages is the most challenging step towards the consolidation of this system since, under physiological conditions, this process takes months in higher mammals. The activation of primordial follicles in the ovarian tissue and their growth to the primary and secondary stages is the most challenging step towards the consolidation of this system since, under physiological conditions, this process takes months in higher mammals. The activation process of dormant primordial follicles in the ovarian pool is a physiological event that is still poorly understood, which is why artificial follicular activation is a great challenge. The PI3K signaling pathway appears to be directly involved in the activation of primordial ovarian follicles. The inhibition of PTEN, a fundamental negative regulator of PI3K, appears to promote activation of these follicles in vitro, however, with modest success with continued growth and development, mainly due to important impacts on the follicular structure and tissue stroma. Our study aimed to expose bovine ovarian cortex tissue to bpV(pic), a PTEN inhibitor under different conditions and evaluate its effects on follicles and ovarian stroma. Ovarian fragments were cultured with bpV(pic) at 1, 10 or 100µM for 12, 24 and 48h (9 treated groups) and kept in culture until complete seven days. A fresh control and a cultured control were compared to the treated groups regarding (a) follicular development, through histomorphometric classification, (b) PI3K activation, indicated by nuclear extrusion of the Foxo3 transcription factor by IHC assay, (c) follicular apoptosis and (d) stroma, by cleaved caspase-3 IHC and (e) quantification of collagen fiber thickness by picrosirius red staining observed under polarized light microscopy. Our findings showed no significant difference in the activation of the PI3K pathway or changes in follicular development rates, however, high doses of bpV(pic) were detrimental to follicular survival. When compared with the cultured control group, fragments treated with 100µM showed up to double the apoptosis rates in stromal cells. The use of intermediate doses (10µM) of the drug showed a protective effect on stromal cells. The picrosirius red assay showed a significant influence of prolonged exposure, with a significant reduction in the thickness of collagen fibers, indicating wear in the extracellular matrix in response to the drug. There is a dose-dependent effect of bpV(pic) exposure on follicular vitality and stromal damage. Considering a possible tissue protective activity in intermediate conditions of exposure to the PTEN inhibitor, the use of this molecule associated with other PI3K activators could be an interesting approach for designing a first phase of the multistep culture system.