Objetivo: Objetivamos investigar os efeitos do tempo de equilíbrio do protocolo de vitrificação e o impacto de um meio de vitrificação suplementado com ácidos graxos (AG) e L-carnitina (LC) no desenvolvimento embrionário e perfil lipídico de oócitos murinos. Adicionalmente, analisar o impacto da estimulação ovariana, fertilização in vitro (FIV) e vitrificação de oócitos com meio padrão e suplementado com AG e LC no perfil lipídico de blastocistos murinos. Material e métodos: Estudo experimental incluindo 936 oócitos murinos C57BL/6J, divididos aleatoriamente em FIV fresco (CTR) e grupos de exposição à solução de equilíbrio (ES). Os oócitos foram expostos ao ES dos meios Irvine (IRV), Tvitri-4 (T4) ou T4 suplementado com LC e AG (T4-LC/FA) por 7 ou 10 minutos, vitrificadosaquecidos e submetidos à FIV. Também avaliamos o perfil lipídico de oócitos imediatamente após a exposição a solução de equilíbrio (ES) utilizando os mesmos tempos de equilíbrio. O desenvolvimento embrionário, a análise do perfil lipídico do oócito e análise da via lipídica foram comparados entre os grupos. Também comparamos o perfil lipídico de blastocistos produzidos in vivo a partir de ciclos naturais de acasalamento (N), produzidos in vivo após superovulação (S) e acasalamento, ou produzidos in vitro após superovulação e FIV. Para os experimentos in vitro, oócitos foram divididos aleatoriamente em 4 grupos: oócitos frescos fertilizados in vitro e grupos vitrificados utilizando os meios de vitrificação descritos previamente. Oócitos frescos ou vitrificados/aquecidos foram inseminados e cultivados in vitro. O perfil lipídico dos oócitos e blastocistos foi avaliado por meio de perfil de monitoramento de reações múltiplas (MRM). Resultados: O maior tempo de equilíbrio resultou em menores taxas de sobrevida oocitária e formação de blastocistos, redução da abundância relativa de lipídios estruturais, como fosfatidilcolinas e esfingomielinas, variando de acordo com a composição de ES. Também induziu a formação bolhas na superfície do oócito predominantemente em IRV, raramente em T4 e ausentes em T4-LC/FA. A fim de revelar as vias metabólicas associadas à fase de equilíbrio da vitrificação, a análise da via lipídica foi realizada e ambos, valores de p e valores de impacto das vias mostraram que o metabolismo do ácido linoleico (p=0.00223; impacto =1) e metabolismo do ácido alfalinoléico (p=0.00084; impact = 0.33) foram as vias mais impactadas, seguida do metabolismo dos glicerofosfolipídios (p=0.0167; impact = 0.25). A estimulação ovariana somente ou associada à FIV promoveu um enriquecimento de fosfolipídios saturados em blastocistos. A vitrificação resultou em uma abundância relativa reduzida de fosfolipídios e esfingolipídios em comparação com blastocistos gerados a partir de oócitos frescos de FIV. Conclusões: Uma fase de equilíbrio mais longa pode influenciar o desenvolvimento embrionário e induzir mudanças na composição lipídica do oócito relacionadas à integridade da membrana. Os resultados sugerem internalização dos ácidos oleico e linoléico adicionados ao ES pelo oócito e, de certa forma, parecem contribuir para a preservação dos fosfolipídios da membrana, independentemente dos tempos de equilíbrio avaliados. Várias classes de fosfolipídios foram afetadas em blastocistos pela S, FIV e/ou vitrificação de oócitos, e mesmo um curto tempo de exposição às soluções à base de lipídios durante a vitrificação do oócito foram suficientes para induzir alterações no perfil lipídico que foram sustentadas até estágio de blastocisto.

Objective: We aimed to investigate the effects of equilibration time and the impact of a vitrification medium supplemented with oleic and linoleic fatty acids (FA) and Lcarnitine (LC) on embryonic development and on lipid profile of mice oocytes. Additionally, we aimed to analyze the impact of superovulation, in vitro fertilization (IVF) and oocyte vitrification on lipid profile of mice blastocysts and the role of LC and FA added to the vitrification media on the lipid profile of blastocysts. Material and methods: Experimental study including 936 C57BL/6J mice oocytes randomly divided into fresh IVF (CTR) and equilibration solution groups (ES). Oocytes were exposed to ES of Irvine (IRV), Tvitri-4 (T4) or T4 media supplemented with LC and FA (T4-LC/FA) for 7 or 10 minutes, vitrified-warmed and subjected to IVF. We also evaluated the lipid profile of oocytes immediately after exposure to ES using the same equilibration times. Embryonic development, oocyte lipid profile analysis and lipid pathway analysis were compared between groups. We also compared the lipid profile of blastocysts produced in vivo from natural mating cycles (N), produced in vivo after superovulation (S) and mating, or produced in vitro after superovulation and IVF. For in vitro experiments, oocytes were randomly divided into 4 groups: fresh in vitro fertilized oocytes and vitrified groups using the previously described vitrification media. Fresh or vitrified/warmed oocytes were inseminated and cultured in vitro. Lipid profile of oocytes and blastocysts was evaluated through multiple reaction monitoring profile (MRM profiling) method. Results: The longer equilibration time resulted in lower oocyte survival rates and blastocyst formation, reduction of the relative abundance of structural lipids, such as phosphatidylcholines and sphingomyelins, varying according to the ES composition. It also induced the formation of bubbles on the surface of the oocyte predominantly in IRV, rarely in T4 and absent in T4-LC/FA. In order to reveal the metabolic pathways associated to the equilibration phase of vitrification, lipid pathway analysis was conducted and both p-values and pathway impact values showed that the linoleic acid metabolism (p=0.00223; impact =1) and alpha-Linolenic acid metabolism (p=0.00084; impact = 0.33) were the most pathway perturbed, followed by glycerophospholipid metabolism (p=0.0167; impact = 0.25). Ovarian stimulation alone or associated with IVF promoted an enrichment of saturated phospholipids in blastocysts. Vitrification resulted in a reduced relative abundance of phospholipids and sphingolipids compared to blastocysts generated from fresh IVF oocytes. Conclusions: A longer e equilibration phase can influence embryonic development and induce changes in oocyte lipid composition related to membrane integrity. The results suggest the internalization of oleic and linoleic acids added to the ES by the oocyte and, to some extent, seem to contribute to the preservation of membrane phospholipids, regardless of the equilibration times assessed. Several classes of phospholipids were affected in blastocysts by S, IVF and/or oocyte vitrification, and even a short time of exposure to lipid-based solutions during oocyte vitrification was sufficient to induce changes in the lipid profile that sustained until the blastocyst stage.