CONTEXTO: A enzima Nicotinamide Nucleotide Transidrogenase (NNT) é fundamental para os mecanismos de defesa antioxidante mitocondriais e parece ser essencial para as etapas da esteroidogênese que ocorrem na mitocôndria. Mutações no gene NNT foram recentemente encontradas em pacientes com deficiência familiar de glicocorticoide (DFG). Entretanto, os mecanismos envolvidos são parcialmente conhecidos e não está claro por que a produção de aldosterona não parece ser comprometida. OBJETIVOS: Avaliar como a NNT atua na esteroidogênese adrenal e verificar a importância dessa enzima na esteroidogênese testicular. MÉTODOS: Caracterização da expressão de NNT em tecidos adrenal e testicular por meio de imunoistoquímica. Para determinar o papel específico da NNT na esteroidogênese adrenal, construímos um modelo nocaute (KO) estável do gene NNT na linhagem celular adrenal H295R usando a tecnologia CRISPR/Cas9. Avaliamos o efeito das alterações do NNT no tráfego de Colesterol (NBD-Colesterol) e nos parâmetros mitocondriais, bem como na esteroidogênese adrenal pela produção de cortisol (RIA) e aldosterona (ELISA). Para avaliar a esteroidogênese gonadal em células testiculares MA-10, inibimos a expressão do RNAm de Nnt usando siRNA e avaliamos os parâmetros mitocondriais, bem como a esteroidogênese gonadal avaliando a produção de testosterona (RIA). RESULTADOS: Nos tecidos avaliados NNT foi mais expressa na zona de transição de adrenais fetais. Em adrenais adultas essa proteína é mais expressa na zona fasciculada do córtex adrenal. Em testículos fetais a proteína NNT foi mais expressa em células de Leydig. O clone selecionado após a inibição do NNT pelo sistema CRISPR/Cas9 mostrou aumento da produção de EROs, diminuição na marcação mitocondrial e diminuição do tamanho e densidade de gotículas de colesterol e comprometimento na secreção de cortisol e aldosterona. Em comparação com o tipo selvagem, a variante NNT p.G866D, em homozigose, exibiu um aumento na produção de EROs. A inibição da expressão do gene Nnt na linhagem celular testicular alterou os parâmetros mitocondriais, mas manteve a secreção de testosterona. CONCLUSÕES: Mutações com perda de função da NNT prejudicam os mecanismos antioxidantes por comprometerem o sistema da glutationa redutase, resultando no acúmulo de ROS. Sem NNT as células adrenais diminuem secreção de cortisol e de aldosterona. Por outro lado, em células testiculares, a redução da NNT compromete o mecanismo REDOX, porém não é suficiente para reduzir a produção de testosterona. Juntos, esses dados esclarecem os mecanismos pelos quais as mutações do NNT resultam em insuficiência adrenal primária sem insuficiência gonadal.

Context: NNT is essential in the mitochondrial antioxidant defense mechanisms and appears to be crucial to the stages of steroidogenesis that occur in mitochondria. Mutations in the NNT gene have been found in some patients with FGD. It is unknown why zona glomerulosa is not or rarely affected in patients with FGD and nothing is known about the possible impairment of the zona reticularis or gonadal steroidogenesis. OBJECTIVES: To evaluate NNT action on adrenal steroidogenesis and importance of this enzyme in testicular steroidogenesis. METHODS: First we analyzed by IHC NNT expression in the adrenal cortex and testis. To ascertain NNT specific role in adrenal steroidogenesis, we built a stable knockdown model of the NNT gene in the H295R adrenal cell line using CRISPR/Cas9 technology. We evaluated the effect of alterations in NNT on Cholesterol Trafficking (NBD-Cholesterol) and on mitochondrial parameters as well as on adrenal steroidogenesis by measuring cortisol (RIA) and aldosterone (ELISA) production. To evaluated NNT role in gonadal steroidogenesis, we knocked down the Nnt mRNA using siRNA and evaluated mitochondrial parameters as well as gonadal steroidogenesis by testosterone (RIA) in MA-10 testis cell line. Results: In tissues evaluated NNT was more expressed in the transition zone in fetal adrenals. In adult adrenal this protein is more expressed in the zona fasciculata of the adrenal cortex. In fetal testis, NNT protein is expressed in Leydig cells. NNT knockout by the CRISPR/Cas9 system resulted in increased ROS production, decreased mitochondrial stain, and decreased size and density of cholesterol lipid droplets as well as cortisol and aldosterone secretion. Compared to wild type (WT), the homozygous p.G866D NNT variant exhibited increased ROS production. The inhibition of Nnt gene expression in testis cells also impaired several mitochondrial parameters but did not decrease testosterone production. Conclusion: Loss-of-function NNT mutations impair antioxidants mechanisms by affecting the glutathione reductase system, resulting in accumulation of ROS. NNT impairment in adrenal cells decreases cortisol and aldosterone secretion but note testosterone production in the testis. Altogether, these data enlighten the mechanisms by which NNT mutations result in primary adrenal insufficiency without gonadal failure.