A freqüência de anomalias congênitas como causa de mortalidade infantil tende a crescer proporcionalmente, na medida em que as causas de morte evitáveis, tais como prematuridade e suas conseqüências, infecções e desnutrição, podem ser melhor controladas em função da melhoria geral da saúde da população e do próprio sistema de saúde. No Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, as anomalias congênitas representam cerca de um quarto dos casos das necropsias pediátricas, sendo que muitas não têm sua etiologia definida com os recursos disponíveis, pois a cultura celular para a análise de cariótipo, apesar de ter grande valia para o estudo das anomalias congênitas, nem sempre tem sucesso, ora porque os tecidos não são mais cultiváveis, ora por contaminação bacteriana ou fúngica. Por outro lado, muitas vezes a citogenética convencional não é capaz de detectar certas alterações estruturais, como as microdeleções, que devem então ser investigadas com técnicas moleculares. Uma das possibilidades neste sentido é a utilização da Hibridação in situ fluorescente (Fluorescent in situ hybridization - FISH), que pode ser realizada tanto em células em metáfase como em interfase. Apesar de tecnicamente possível, a utilização de tecidos fixados em formol e emblocados em parafina tem muitas limitações, o que motivou a busca de um novo método de análise celular adequado e de baixo custo, representado pelo uso de touch preparatives ou imprints. O objetivo deste trabalho foi determinar um protocolo simplificado e de baixo custo para a investigação de anomalias congênitas no exame post mortem, através da técnica de FISH, em imprints celulares de fígado. Para tanto, foram colhidos imprints de 11 casos de necropsias, fixados em dois diferentes fixadores: metanol-ácido acético (3:1), por 45 segundos, e etanol 95% por 10 minutos. Antes de proceder à técnica de FISH, foi realizado um pré-tratamento com ácido-acético a 70%, por 2 minutos. A técnica de FISH foi realizada utilizando-se sondas alfa-centroméricas dos cromossomos 13/21, 18 e X. Os resultados mostraram que a utilização dos imprints de fígado para a técnica de FISH foi adequada, não havendo diferenças em relação ao sexo, idade e tempo de morte dos indivíduos. Além disso, os imprints são fáceis e rápidos de serem coletados e fixados, apresentando núcleos em número suficiente para a análise interfásica, separados, íntegros e em monocamada, o que propiciou uma análise relativamente rápida e bastante confiável. Quanto aos fixadores, não houve diferença entre os dois utilizados. Portanto, o emprego de imprints de fígado fixados em etanol 95% constitui uma forma de preparação celular adequada para análise citogenética molecular (FISH) e tal protocolo poderá ser adotado na investigação de anomalias congênitas no exame post mortem pelo Departamento de Patologia da FMRP-USP.

The frequency of congenital anomalies in infant mortality rate is expected to increase due to the better control of preventable diseases such as prematurity and its consequences, infections and malnutrition, associated to better health care and improved Health System. At the Hospital das Clínicas da Faculdade de Ribeirão Preto - HCFMRP-USP, congenital anomalies correspond to one quarter of all pediatric autopsies, some of which remain with its etiology undefined. Cell culture for cytogenetics is sometimes of no help due to absent growth, contamination, or because the abnormality is caused by a microdeletion. Fluorescent ln Situ Hibridization (FISH) provides an alternative to these problems as it may be performed on interphase and metaphase nuclei. Although it is technically possible to use formalin fixed and paraffin embedded tissues for FISH there are some limitations to its use and so we looked for a low cost alternative source of cells represented by touch preparatives or imprints. The aim of this study was to difine a simplified and low cost protocol for the investigation of congenital anomalies seen at autopsy using FISH in liver touch preparatives. These touch prepatatives obtained from 11 adult and pediatric autopsies were fixed in either ethanol 95%, for 10 minutes, or methanol:acetic acid 3:1, for 45 seconds, followed by pre-treatment with acetic acid 70% for 2 minutes. Alpha-centromeric probes for chromosomes 13/21, 18 and X were tested according to the protocol of Pinkel, 1986. Our results showed that touch preparatives are a good source of cells for FISH obtained at autopsy, with no sex, age and delay from death to the autopsy difference. They are easy to obtain and prepare, present an adequate amount of whole, isolated and non-overlapping interphase nuclei which provide and easy and reliable analysis. There were no statistical differences between the two fixatives used and thus ethanol 95% should be the fixative of choice due to its lower cost, less toxicity and because it is ready to use. ln conclusion, liver touch preparatives fixed in ethanol 95% are a good source of interphase cells for molecular cytogenetics - FISH - that should be recommended for the investigation of congenital anomalies of autopsies performed at the HCFMRP-USP.