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Mémoire de Maîtrise
DOI
10.11606/D.17.2010.tde-17022011-144706
Document
Auteur
Nom complet
Priscila Alves Balista Ide
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
Ribeirão Preto, 2010
Directeur
Jury
Leite, João Pereira (Président)
Coimbra, Norberto Cysne
Fernandes, Maria José da Silva
Titre en portugais
Inibidores de fosfatidilinositol-3-cinase (PI3K) e neuroproteção mediada pela cascata de sinalização da Akt na fase aguda do modelo de Pilocarpina
Mots-clés en portugais
Akt
epilepsia
LY294002
neuroproteção
PI3K
Wortmanina
Resumé en portugais
Introdução: A epilepsia do lobo temporal (ELT) é a forma mais frequente de epilepsia em adultos. Um modelo experimental de ELT consiste na indução de status epilepticus (SE) em animais por administração de Pilocarpina. Este modelo induz mudanças patofisiológicas e comportamentais em ratos muito semelhantes às observadas em seres humanos com ELT. Apesar da literatura apresentar dados relacionados às respostas celulares, pouco se conhece a respeito do envolvimento de cascatas de sinalização com insultos epileptogênicos no sistema nervoso. A enzima fosfatidilinositol-3-cinase (PI3K) está envolvida na ativação da cascata de sinalização intracelular da Akt. A Akt é uma proteína cinase especifíca de serina/treonina cuja forma ativa proporciona um controle no crescimento e proliferação celular, bem como induz um sinal de sobrevivência para a proteção de células contra a apoptose. Alguns estudos mostram que a ativação da PI3K é inibida por potentes drogas, tais como a LY294002 e a Wortmanina. A PI3K ativa a Akt e a cascata de sinais extra e intracelulares neuroprotetores pós-insultos. O estudo da ação de inibidores da PI3K em modelos de epilepsia pode fornecer dados sobre o envolvimento da Akt em sinais neuroprotetores. Objetivos: Avaliar o efeito do SE por injeção intra-hipocampal de Pilocarpina na ativação da Akt, bem como os efeitos do bloqueio desta cascata sobre as alterações patológicas observadas no hipocampo de ratos na fase aguda pós-SE. Metodologia: Ratos da cepa Wistar machos (250-300 g) foram divididos em grupos de tratamento, sendo tratados com injeções ipsilaterais na região posterior do hipocampo, com uma hora de intervalo entre drogas, das drogas: Salina e Pilocarpina (grupo Sal+Pilo), LY294002 e Pilocarpina (LY+Pilo) e Wortmanina e Pilocarpina (Wort+Pilo). No grupo considerado como controle foram injetadas as seguintes drogas: Salina e Salina (grupo Sal+Sal) ou Dimetilsulfóxido e Salina (grupo DMSO+Sal). O tempo de SE induzido por Pilocarpina foi fixado em 2 horas. Grupos de animais foram sacrificados nos instantes de 1 dia e 7 dias após o SE e seus encéfalos foram processados objetivando a imuno-histoquímica para NeuN, GFAP e Akt (pan). Resultados: A densidade neuronial na região do hilo do hipocampo foi menor no grupo Sal+Pilo, seguido dos grupos LY+Pilo e Wort+Pilo, avaliando-se os vários níveis de formação hipocampal e região posterior. Para a análise da astrogliose, na camada granular, o grupo LY+Pilo apresentou maior número de astrócitos positivos; na região do hilo hipocampal, os grupos LY+Pilo e Wort+Pilo apresentaram baixa expressão para a proteína Akt, comparados aos grupos Controles; assim como o grupo Wort+Pilo, em CA2, apresentou baixa expressão da proteína Akt somente na região posterior. Os animais Sal+Pilo sobrevida-7dias pós-SE revelaram maior expressão da Akt quando comparados com o grupo Sal+Pilo sobrevida-1dia pós-SE. Quanto à análise comportamental, o grupo Wort+Pilo apresentou maior latência para o início do SE que o grupo Sal+Pilo, não sendo observado diferença de severidade, uma vez atingido o SE. Conclusões: Na hipótese de trabalho, o uso de inibidores da fosforilação de Akt resultaria em maior morte neuronial, astrogliose e expressão inalterada da Akt. Ao contrário do esperado, os grupos que receberam injeções intra-hipocampais de inibidores de Akt, antes da indução de SE, exibiram menor perda neuronial, menor astrogliose e menor expressão da Akt para os vários níveis de formação hipocampal e no hipocampo posterior. Porém, o grupo Sal+Pilo sobrevida-7 dias pós-SE exibiu maior expressão para Akt quando comparado com o grupo Sal+Pilo de sobrevida-1 dia pós-SE. Além disso, o pré-tratamento com Wortmanina demonstrou um maior tempo de latência para o início do SE, o que nos sugere uma maior neuroproteção do que LY294002.
Titre en anglais
Inhibitors of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) and neuroprotection mediated by Akt signaling cascade in the acute phase of the pilocarpine model.
Mots-clés en anglais
Akt
Epilepsy
LY294002
neuroprotection
PI3K
Wortmannin
Resumé en anglais
Introduction: Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most frequent type of adult human epilepsy. An experimental model of TLE, the Pilocarpine induced epilepsy, followed by pathofisiologic and behavioural alterations in rats resembling human diagnosis with TLE. Although there are several data on cell response in literature, few information exist on the cascade of signals involved in epileptogenesis process of central nervous system. The phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) is involved in activation of Akt intracellular signaling cascade. The serine/threonine kinase Akt, that in active form promote a control of growth and cell proliferation, such as survival sign protecting cells from apoptosis. Some studies have shown that activation of PI3K is blocked by potents pharmacological inhibitors, for example the LY294002 and Wortmannin. PI3K activate Akt and both extra and intracellular cascade signals involved in neuroprotection after seizures. The study of inhibitors mechanism in model of epilepsy can provide information on the involvement of Akt in signals of neuroprotection. Objectives: To evaluate the effects of SE by the intrahippocampal injection of Pilocarpine in Akt activation, and the effects of the blockade of this cascade on pathologic alterations observed in hippocampus of rats in acute phase after SE as well. Methods: Male Wistar rats (weighing 250 to 300 g) were divided in groups treated ipsilaterally with injections in the posterior region of hippocampus with an elapsed time of one hour subsequently after each injection of following substances: Physiological Saline and Pilocarpine (group Sal+Pilo), LY294002 and Pilocarpine (LY+Pilo), and Wortmannin and Pilocarpine (Wort+Pilo). Control groups were treated with the following drugs Saline + Saline (group Sal+Sal) or Dimethylsulphoxide + Saline (DMSO+Sal). A fixed time of 2 hours was considered for evaluating the SE induced by Pilocarpine. Animals were sacrificed 1 day and 7 days after SE, and their brains were processed imunohistochemically for NeuN, GFAP and Akt (pan) detecting. Results: The neuronal density in the hippocampal hilus was lower in the Sal+Pilo group, followed by LY+Pilo and Wort+Pilo groups, this evaluate various levels of hippocampal formation and posterior region. For the analysis of reactive astrogliosis of the granular cell layer, the LY+Pilo group presented a great number of GFAP-positive astrocytes. In the hilar region, the LY+Pilo and Wort+Pilo groups presented a reduced Akt expression compared to the Control group, such as the group Wort+Pilo in CA2, presented a reduced Akt expression only in posterior region. The Sal+Pilo animals with a survival time of 7 days after SE revealed higher Akt expression when compared to the Sal+Pilo animals with a survival time of 1 day. In behavioural analysis, the Wort+Pilo group presented major time of latency to SE than Sal+Pilo group, without differences in the disease severity, once reached the SE. Conclusions: On the contrary to the original hypothesis of this work, the use of inhibitors of Akt phosphorylating resulted in an unaltered neuronal death, astrogliosis and Akt expression. The groups that received intrahippocampal injection of Akt inhibitors before inducing SE exhibited a reduced neuronal loss, astrogliosis and Akt expression to the various levels of hippocampal formation and posterior region. But, to the Sal+Pilo group with a survival time of 7 days after SE induction exhibited greater Akt expression than Sal+Pilo group with a survival time of 1 day after SE induction. However, the pretreatment with Wortmannin displayed major time of latency to SE induction, suggesting this substance as a better neuroprotector than LY294002, according to the methodology applied in this study.
 
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Date de Publication
2011-04-26
 
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