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Thèse de Doctorat
DOI
https://doi.org/10.11606/T.17.2022.tde-12072022-161805
Document
Auteur
Nom complet
Diego Antonio Pereira Martins
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
Ribeirão Preto, 2022
Directeur
Jury
Rego, Eduardo Magalhães (Président)
Carvalheira, José Barreto Campello
Griessinger, Emmanuel
Traina, Fabíola
Titre en anglais
Evaluation of the TP53/TP73 pathway in the engraftment of primary acute promyelocytic leukemia cells using a xenotransplantation model
Mots-clés en anglais
Prognostic markers
TP53/TP73 pathway
Xenotransplant models
Resumé en anglais
Current murine xenotransplantation models used as in vivo study models of human leukemic processes, particularly in acute myeloid leukemia (AML) have failed to reconstruct the pathophysiological processes related to the disease due to their non-similarity to the human bone marrow (BM) niche. Thus, the evaluation of the processes of self-renewal, differentiation, and transformation of human hematopoietic (HSCs) and leukemic (LSCs) stem cells, as well as their evaluation of the effectiveness of new treatment modalities, must be carried out in species-specific microenvironments. This is supported by the fact that some leukemic subtypes (categorized with favorable prognosis regarding the disease course), such as the acute promyelocytic leukemia (APL), present recurrent graft failure in xenotransplantation models. Despite their favorable prognosis against other subtypes of AML, this subtype still has a high risk of relapse often associated with drug-resistance. In this sense, it is believed that genetic variations that confer greater resistance to the leukemic clone may influence the grafting capacity of these cells, favoring in vivo evaluation. Previous studies from our group have shown that a higher ΔNp73/TAp73 expression ratio is associated with a worse prognosis in APL (lower overall survival [OS] and disease-free survival [DFS]) and resistance to cytarabine-induced apoptosis. ΔNp73, a truncated form of the TP73 gene, acts as a potent inhibitor of the transcriptional activity of TP53 and TAp73 proteins, thus playing an important role in cell proliferation and death. Thus, the oncogenic activity of the TP73 gene is determined by the balance between its transcriptionally active (TAp73) and inactive (ΔNp73) isoforms, and this relationship is correlated with the clinical prognosis and treatment failure in several human neoplasms. Thus, the present work aims to determine whether alterations in the TP53/TP73 pathway are associated with an engraftment capacity of cells isolated from APL patients in humanized xenotransplantation models. Moreover, we investigated the mechanisms by which the TP53/TP73 pathway can confer grafting advantages to PML-RARA+ cells, such as changes in cell proliferation, viability, and differentiation. Furthermore, we evaluated the transcriptome of patients with APL and AML with different expression levels of ΔNp73/TAp73, to identify possible targets of TP53/TP73 regulation. In CD34+ cells isolated from healthy donors, overexpression of ΔNp73α/β isoforms resulted in increased cell proliferation and colony formation in long-term cultures (35 days) compared to the empty vector control (pMEG). In APL cell lines (NB4 and NB4-R2), overexpression of ΔNp73α/β promoted an increase in cell proliferation, viability in response to cytotoxic agents, and decreased granulocytic differentiation induced by all-trans retinoic acid. Conversely, overexpression of TAp73α promoted the reversal of all phenotypes observed with ΔNp73, resulting in sensitization to arsenic trioxide (ATO) in an ATO-resistant APL model. Furthermore, in vivo patient derived xenotransplant models using NSGS mice demonstrated that primary APL blasts transduced with ΔNp73 had a superior engraftment in the BM, peripheral blood, and spleen of the mice. In the context of AML, patients with high expression of ΔNp73 isoforms had higher leukocyte counts, with the ΔNp73/TAp73 ratio being associated with lower OS and DFS. Furthermore, at the transcriptional level, patients with high ΔNp73 were associated with the terms "HSC UP" and "LSC UP", and negatively correlated with the terms "GMP UP" and "TP53 regulates cell cycle arrest". In cell lines, the overexpression of the ΔNp73α/β isoforms resulted in proliferative and cell survival advantages in cell models that did not contain mutations in the TP53 gene (MOLM13, MV4-11, OCI-AML3 and HL60), although no effect was observed in the cell lines containing mutations in TP53 (TF-1 and KG1). The silencing of TP53 gene expression in wild-type TP53 cells reduced the effects of overexpression of ΔNp73α/β isoforms. Mechanistically, high ΔNp73 expression resulted in reduced TP53 expression and increased DHODH expression. In conclusion, overexpression of ΔNp73 isoforms conferred cell survival advantages on AML cells, resulting in engraftment of primary cells from patients diagnosed with APL in a xenotransplantation model.
Titre en portugais
Avaliação da via TP53/TP73 na enxertia de células de leucemia promielocítica aguda em modelo de xenotransplante
Mots-clés en portugais
Marcadores prognósticos
Via TP53/TP73
Xenotransplante
Resumé en portugais
Os atuais modelos murinos de xenotransplante utilizados como modelos de estudo in vivo dos processos leucêmicos humanos, particularmente na leucemia mieloide aguda (LMA) tem falhado na reconstrução dos processos fisiopatológicos relacionados a doença devido a não similaridade com o nicho medular humano. Deste modo, a avaliação dos processos de alto-renovação, diferenciação e transformação das células tronco hematopoiéticas humanas (HSCs) e leucêmicas (LSCs), bem como sua avaliação quanto a eficácia de novas modalidades de tratamento, devem ser realizadas em microambientes espécie-específicos. Isto é suportado pelo fato de alguns subtipos leucêmicos (presentes no grupo de prognóstico favorável da doença), como a leucemia promielocítica aguda (LPA), apresentam recorrente falha de enxertia em modelos de xenotransplante. Apesar do seu prognóstico favorável frente a outros subtipos de LMA, este subtipo ainda apresenta elevado risco de recaída frequentemente associado a resistência a terapia utilizada. Neste sentido, acredita-se que variações genéticas que confiram maior resistência ao clone leucêmico podem influenciar na capacidade de enxertia destas células, favorecendo sua avaliação in vivo. Estudos prévios do nosso grupo demonstraram que uma maior relação de expressão ΔNp73/TAp73 está associada com pior prognóstico na LPA (menor sobrevida global [SG] e sobrevida livre de doença [SLD]) e resistência à apoptose induzida por citarabina. O ΔNp73, forma truncada do gene TP73, atua como um potente inibidor da atividade transcricional das proteínas TP53 e TAp73, desempenhando, desta forma, um importante papel na proliferação e morte celular. Assim, a atividade oncogênica do gene TP73 é determinada pelo balanço entre suas isoformas transcricionalmente ativa (TAp73) e inativa (ΔNp73), e essa relação correlaciona-se com o prognóstico clínico e falha no tratamento em diversas neoplasias humanas. Desta forma, o presente trabalho tem como objetivo determinar se alterações na via do TP53/TP73 estão associadas com uma maior capacidade de enxertia em células de pacientes com LPA em modelos de xenotransplante humanizados. Subjacente a isto, investigamos os mecanismos pelos quais a via TP53/TP73 podem conferir às células PML-RARA+ vantagens de enxertia, tais como modificações na proliferação, viabilidade e diferenciação celular. Ademais, avaliamos o transcriptoma de pacientes com LPA e LMA com diferentes níveis de expressão do ΔNp73/TAp73, a fim de identificar possíveis alvos de regulação do TP53/TP73. Em células CD34+ isoladas de doadores saudáveis, a hiperexpressão das isoformas ΔNp73α/β resultou em aumento da capacidade de proliferação e formação de colônias em culturas de longa duração (35 dias) em comparação com o vetor vazio (pMEG). Nas linhagens de LPA (NB4 e NB4-R2), a hiperexpressão do ΔNp73α/β promoveu um aumento da proliferação, viabilidade celular em resposta a agentes citotóxicos, e menor diferenciação granulocitíca induzida pelo ácido all-trans retinóico. De maneira inversa, a superexpressão de TAp73α promoveu a reversão de todos os fenótipos observados com o ΔNp73, resultando em sensibilização ao trióxido de arsênico (ATO) em um modelo de LPA resistente ao ATO. Estes achados foram validados utilizando a linhagem Ba/F3-PML-RARA transduzida com as diferentes isoformas do TP73. Ademais, o xenotransplante de animais NSGS com células primárias de pacientes com LPA, transduzidas com o pMEG e o ΔNp73α demonstrou que as células ΔNp73α apresentaram um maior potencial de enxertia na medula óssea, sangue periférico e baço dos animais. No contexto da LMA, pacientes com alta expressão das isoformas ΔNp73 apresentaram maiores contagens de leucócitos, sendo a razão ΔNp73/TAp73 associada com menor SG e SLD. Ademais, ao nível transcricional, pacientes com alto ΔNp73 apresentaram enriquecimento para os processos associados com "HSC UP" e "LSC UP", e negativamente correlacionados com os termos "GMP UP" e "TP53 regulates cell cycle arrest". Em modelos celulares, a superexpressão das isoformas ΔNp73α/β resultou em vantagens proliferativas e de sobrevivência celular nos modelos celulares que não continham mutações no gene TP53 (MOLM13, MV4-11, OCI-AML3 e HL60), embora nenhum efeito tenha sido observado nas linhagens celulares contendo mutações em TP53 (TF-1 e KG1). O silenciamento da expressão do gene TP53 em linhagens TP53 wild-type reduziu os efeitos da superexpressão das isoformas ΔNp73α/β. Mecanisticamente, elevada expressão de ΔNp73 resultou em redução da expressão de TP53 e aumento da expressão de DHODH, cujo efeitos puderam ser revertidos com o uso do inibidor farmacológico de DHODH - Brequinar, em combinação com o agente demetilante Decitabina. Em conclusão, a hiperexpressão das isoformas ΔNp73 conferiu vantagens de sobrevivência celular as células de LMA, resultando na enxertia das células primarias de pacientes diagnosticados com LPA em modelo de xenotransplante.
 
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Date de Publication
2022-08-04
 
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