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Doctoral Thesis
DOI
https://doi.org/10.11606/T.17.2021.tde-04082021-134444
Document
Author
Full name
Camila Marcelino Loureiro
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Ribeirão Preto, 2021
Supervisor
Committee
Júnior, Paulo Louzada (President)
Belangero, Síntia Iole Nogueira
Ferraz, Victor Evangelista de Faria
Salum, Cristiane Otero Reis
Title in Portuguese
Estudo translacional do receptor N-metil-d-aspartato em primeiro episódio psicótico e em modelos animais de psicose
Keywords in Portuguese
Aminoácidos
Biomarcadores metabólicos
Espectrometria de massa por cromatografia em fase gasosa
Esquizofrenia
Expressão de proteínas
Expressão de RNAm
Fenciclidina
GRIN1
GRIN2A
GRIN2B
Irmãos
Isolamento social após o desmame
Metilação do DNA
NMDAR
Primeiro episódio psicótico
Trauma na infância
Variante de nucleotídeo único
Abstract in Portuguese
Introdução. A metilação do DNA pode mediar as interações gene-ambiente nas psicoses. O receptor N-metil-d-aspartato (NMDAR) é essencial para o neurodesenvolvimento, além de ser sensível a estressores ambientais, como o trauma na infância. No entanto, os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento das psicoses são pouco elucidados. Por isso, desenvolvemos um estudo translacional para investigar as influências genético-epigenético-ambiental no primeiro epsiódio psicótico (PEP) e em modelos animais de psicose (ambiental e farmacológico). Objetivos. Humanos: comparar o perfil de aminoácidos relacionados ao sistema glutamatérgico, as variantes de nucleotídeo único (SNVs) e a metilação do DNA dos genes GRIN1, GRIN2A e GRIN2B do NMDAR no sangue de pacientes em PEP, irmãos não psicóticos e controles da comunidade. Em adição, investigar se a exposição ao trauma na infância poderia influenciar os parâmetros investigados. Animais: comparar as expressões gênica e protéica e a metilação dos genes Grin1, Grin2a e Grin2b do NMDAR em amostras cerebrais [hipocampo e córtex pré-frontal (CPF)] e no sangue de ratos submetidos ao isolamento social após o desmame e nas mesmas estruturas cerebrais de ratas submetidas ao tratamento com fenciclidina subcrônica (PCP), avaliando também se as alterações são tecidoespecíficas e se ocorrem correlações cérebro-sangue. Métodos. Humanos: estudo casocontrole, transversal. Incluídos 166 pacientes em PEP, 76 irmãos e 166 controles pareados por idade e sexo nas análises de aminoácidos (cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas) e SNVs (RT-PCR). Selecionados 35 pacientes com espectro da esquizofrenia, 21 irmãos e 35 controles pareados por idade, sexo e escolaridade nas análises de metilação do DNA (pirosequenciamento). Animais: ratos da linhagem Wistar alojados isoladamente ou em grupos logo após o desmame (21 dias; n=10/grupo) durante 10 semanas e expostos ao teste do campo aberto. Ratas da linhagem Hooded-Lister abrigadas em dois grupos (n=10/grupo) em ratas que receberam 2 mg/kg de PCP ou veículo por sete dias. Após os testes comportamentais, os tecidos cerebrais foram dissecados para as extrações de RNA/DNA e as subunidades do NMDAR mensuradas por qRT-PCR, ELISA e pirosequenciamento. Para humanos e animais, os dados foram analisados usando testes paramétricos e não paramétricos de acordo com a distribuição dos dados. Resultados. Humanos: pacientes em PEP - redução dos níveis plasmáticos de GABA comparados aos irmãos e controles; hipermetilação do LINE-1 e hipometilação do GRIN2B com os CpGs correlacionados à menor QI comparados aos controles. Irmãos não psicóticos - redução plasmática do ácido glutâmico, ácido glutâmico+glutamina e prolina comparados aos controles e aumento de triptofano comparados aos pacientes e controles; maior frequência da variante G do rs1805502 (GRIN2B) e hipermetilação do LINE-1 comparados aos controles e hipermetilação do GRIN1 nos irmãos com trauma na infância em relação aos irmãos sem trauma. Controles - hipometilação de GRIN2B associado ao trauma na infância. Animais: animais isolados - hiperlocomoção na periferia e centro da arena; RNAm diminuído no CPF para todos os marcadores; aumento da proteína NR1 no hipocampo e sangue; hipermetilação de Grin1 no CPF e sangue e do Grin2b no hipocampo e sangue. Ratas submetidas ao PCP - prejuízos no reconhecimento de novos objetos; níveis aumentados de RNAm de Grin2a e Grin2b no CPF; baixos níveis de proteína NR1 no CPF e hipocampo; hipermetilação do Grin1 e Grin2b no CPF e no hipocampo. Associações entre RNAm/proteína e metilação do DNA encontradas em ambas as áreas cerebrais e no sangue. Conclusão. Humanos: os pacientes em PEP apresentaram redução plasmática de GABA e os irmãos não afetados podem ser um possível grupo de risco para anormalidades metabólicas, bem como os irmãos apresentaram maior frequencia da variante de risco relacionada ao GRIN2B. A repressão epigenética do GRIN2B pode ser um fator contribuinte no primeiro episódio de esquizofrenia e associado à redução do QI em pacientes. Animais: alterações na metilação observadas nos modelos animais podem estar subjacentes às mudanças nas expressões de RNAm/proteínas do NMDAR causadas pela criação do isolamento e pela administração de PCP. Essas alterações podem estar correlacionadas com interrupções na neurotransmissão glutamatérgica, resultando em um desequilíbrio excitatório semelhante ao que ocorre nas psicoses. No entanto, a direção oposta da metilação do DNA entre humanos e animais pode ser explicada pelas diferentes sequências de DNA estudadas. Este estudo apóia a nossa hipótese de que as alterações nos NMDARs estão presentes no cérebro e sangue, sugerindo que os mecanismos epigenéticos estão envolvidos na fisiopatologia das psicoses e podem ser alvos para futuras estratégias farmacoterapêuticas.
Title in English
Translational study of the N-methyl-d-aspartate receptor in a first psychotic episode and in animal models of psychosis
Keywords in English
Amino acids
Childhood trauma
DNA methylation
First episode-psychosis
Gas chromatography mass spectrometry
GRIN1
GRIN2A
GRIN2B
Isolation rearing from weaning
Metabolic biomarkers
mRNA expression
NMDAR
Phencyclidine
Protein expression
Schizophrenia
Siblings
Single nucleotide variant
Abstract in English
Background. DNA methylation can mediate gene-environment interactions in psychosis. Nmethyl-d-aspartate receptor (NMDAR) is essential for neurodevelopment, as well as are sensitive to environmental stressors, such as childhood trauma. However, the mechanisms underlying the development of these disorders are poorly elucidated. For this reason, our study has a strong translational relevance integrating genetic-epigenetic-environmental factors in first-episode psychosis (FEP) patients and on animal models of psychosis (early stress and pharmacology). Aims. Humans: to compare the amino acids profile related to the glutamatergic system, the single nucleotide variants (SNVs) and DNA methylation of the GRIN1, GRIN2A and GRIN2B NMDAR genes in blood samples from first-episode psychsosis (FEP) patients, non-psychotic siblings and community-based controls. In addition, to investigate whether exposure to childhood trauma could influence the parameters investigated. Animals: we compared the NR1 and NR2 mRNA/protein and the DNA methylation of Grin1, Grin2a and Grin2b of NMDAR promoter region in the blood, prefrontal cortex (PFC) and hippocampus of male Wistar rats exposed to isolation rearing and in the PFC and hippocampus of female ListerHooded rats submitted to phencyclidine (PCP) administration. We also verified if these alterations are tissue-specific or if the brain changes are extended to the blood. Methods. Humans: This is a case-control, cross-sectional study. Included 166 FEP patients, 76 siblings and 166 controls matched for age and sex for the analysis of amino acids (gas chromatographymass spectrometry) and SNVs (RT-PCR). Selected a subsample of 35 patients with schizophrenia spectrum, 21 siblings and 35 controls matched for age, sex and years of schooling for DNA methylation analysis (pyrosequencing). Animals: Wistar rats were kept isolated or grouped (n=10/group) from weaning for 10 weeks and then exposed to the Open Field; while Lister-Hooded rats were sheltered in two groups (n=10/group) divided in rats that received 2 mg/kg of PCP or vehicle for seven days. Afterwards the behavioural tests, the tissues were dissected for RNA/DNA extractions and NMDAR subunits were analysed using qRT-PCR, ELISA and pyrosequencing. For humans and animals, data were analysed by parametric and non-parametric tests. Results. Humans: FEP patients - reduced GABA plasma levels when compared to siblings and controls; LINE-1 hypermethylation and GRIN2B hypomethylation when compared to controls with CpGs correlated with a measure of intellectual quotient. Nonpsychotic Siblings - reduced glutamic acid, glutamic acid+glutamine and proline plasma levels in comparison to controls and increased tryptophan when compared to FEP patiens and controls; higher genotype frequency of SNV rs1805502 (GRIN2B) when compared to controls; LINE-1 hypermethylation in comparison to controls; GRIN1 hypermethylation in siblings with childhood trauma in comparison to siblings without a history of trauma. Controls - GRIN2B hypomethylation associated with childhood trauma. Animals: isolated-reared animals - hyperlocomotion in the periphery and in the centre of the arena when compared to the grouped; decreased mRNA in PFC for all markers; increased NR1 protein in the hippocampus; hypermethylation of Grin1 in PFC and blood and Grin2b in hippocampus and blood, compared to grouped rats. PCP rats - increased mRNA levels of Grin2a and Grin2b in the PFC; low NR1 protein levels in the PFC and in the hippocampus and hypermethylation of Grin1 and Grin2b in PFC and hippocampus. Associations between mRNA/protein and DNA methylation were found for both brain areas and in the blood. Conclusions. Humans: FEP patients presented reduced GABA plasma profile, while unaffected siblings may be a possible risk group for metabolic abnormalities, as well as siblings presented higher frequency of risk variant related to the GRIN2B gene. Epigenetic hyper-repression of the GRIN2B promoter may be a contributing factor in the first episode of schizophrenia and associated with intelligence quotient impairments in patients. Animals: this study indicates that epigenetic DNA methylation may underlie NMDAR mRNA/protein expression alterations caused by isolation rearing and/or by PCP administration. Alterations in NMDAR genes of animals may correlated with disruptions in glutamatergic neurotransmission, resulting in an imbalance in the excitatory equivalent to that seen in psychosis. However, the opposite direction of DNA methylation between human and rat studies may be explained by the different DNA sequences studied. This study supports our hypothesis that changes in NMDARs are present across the brain-blood, indicating that epigenetic mechanisms are involved in the pathophysiology of schizophrenia and other psychoses and can be valuable targets for future pharmacotherapeutic strategies.
 
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Publishing Date
2021-08-09
 
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