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Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/T.17.2020.tde-30052019-161108
Documento
Autor
Nome completo
Ana Carolina Santana
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2018
Orientador
Banca examinadora
Jamur, Maria Celia (Presidente)
Bisson, Gabriela Silva
Sartori, Daniela Carlos
Arruda, Luisa Karla de Paula
Oliani, Sonia Maria
Título em português
SAMSN1: proteína adaptadora essencial na função de mastócitos
Palavras-chave em português
Homing
Mastócitos
Migração
Recrutamento
SAMSN1
Resumo em português
Os mastócitos são células multifuncionais originadas na medula óssea que residem no tecido conjuntivo. O processo de migração celular é crucial para o deslocamento dos mastócitos da medula óssea para os sítios periféricos. A SAMSN1 é membro de uma nova família de proteínas adaptadoras do tipo scaffold que contém os domínios SH3 e SAM (Sterile alpha motif). O objetivo deste estudo foi investigar o papel de SAMSN1 em mastócitos. O presente trabalho mostra, pela primeira vez, a expressão de SAMSN1 em mastócitos RBL-2H3 e mastócitos derivados da medula óssea (BMMC). A SAMSN1 está presente na superfície celular, no citoplasma, no núcleo e em organelas como complexo de Golgi e grânulos de mastócitos. A função de SAMSN1 em mastócitos foi investigada com o uso de camundongos deficientes em SAMSN1 (SAMSN1-) e mastócitos RBL-2H3 knockdown para SAMSN1. Os mastócitos RBL-2H3 foram transduzidos com partículas lentivirais que codificam shRNAs para SAMSN1. Os mastócitos RBL-2H3 knockdown apresentaram uma redução de 75% nos níveis de RNA mensageiro para SAMSN1 e cerca de 55% de redução nos níveis da proteína. Nos camundongos SAMSN1-, o número de mastócitos é menor na pele (50%) e na língua (30%) em comparação com camundongos WT. Por outro lado, o número de mastócitos do lavado peritoneal de camundongos SAMSN1- é similar ao de camundongos WT. No entanto, o recrutamento de mastócitos para a cavidade peritoneal de camundongos SAMSN1-, em presença de IL-3 e SCF, é reduzido em 50% em comparação aos camundongos WT. Ainda, a migração de BMMC SAMSN1- em presença de IL-3 é reduzida em 80% e com SCF em 40% quando comparada com BMMC WT. Estes achados foram confirmados com mastócitos RBL- 2H3 knockdown para SAMSN1. A velocidade média de migração também foi menor para BMMC SAMSN1- em comparação aos BMMC WT. Quando estimulados via Fc?RI, os BMMCs SAMSN1- se espalham menos no substrato em comparação com os BMMCs WT. Ainda, durante a migração, poucos filopódios e lamelipódios são observados em BMMC SAMSN1-. A expressão de cortactina e vimentina também está diminuída. Porém, a expressão de vinculina, talina, bem como, das GTPases RhoA, Rac1 e Cdc42 foi similar entre BMMC SAMSN1- e BMMC WT. A diminuição do espalhamento celularResumo iii de BMMCs SAMSN1- não foi suficiente para reduzir a liberação do mediador pré- formado ?-hexosaminidase por estas células. Os resultados da presente investigação mostram que a SAMSN1 está envolvida no homing e no recrutamento de mastócitos, o que ocorre durante processos alérgicos e inflamatórios. Assim sendo, a SAMSN1 pode ser um alvo para novas estratégias terapêuticas a serem usadas nestes processos.
Título em inglês
SAMSN1: an adaptor protein essential for mast cell function
Palavras-chave em inglês
Homing
Mast cells
Migration
Recruitment
SAMSN1
Resumo em inglês
Mast cells (MCs) are multifunctional cells derived from bone marrow, that reside in connective tissue. Cell migration is essential for MCs to exit the bone marrow and go to peripheral sites. SAMSN1, a member of a novel gene family of putative adaptor and scaffold proteins containing SH3 and SAM (sterile alpha motif) domains, has not previously been reported in MCs. Therefore, the aim of this study was to investigate the role of SAMSN1 in MCs. In the present study, SAMSN1 was detected in RBL-2H3 MCs and bone marrow derived MCs (BMMCs). SAMSN1 was localized at the cell surface, in the cytoplasm and in the nucleus of RBL-2H3 MCs. When RBL-2H3 MCs were stimulated via Fc?RI, most of the SAMSN1 was found in the nucleus. SAMSN1 was also localized in the Golgi apparatus and MC granules. In order to investigate the role of SAMSN1 in MCs, SAMSN1 deficient mice (SAMSN1- mice) and SAMSN1 knockdown RBL-2H3 MCs were used. RBL-2H3 MCs were transduced with lentiviral particles encoding shRNAs against SAMSN1. The transduced cells showed an 75% reduction in SAMSN1 mRNA levels and around a 55% reduction in protein levels. The number of MCs at peripheral sites was lower in the SAMSN1- mice. Metachromatic MCs were 50% and 30% lower in the skin and tongue, respectively, in SAMSN1- mice in comparison to WT mice. On the other hand, the number of MCs in the peritoneal cavity in SAMSN1- mice was similar when compared to WT mice. However, after intraperitoneal injection of the chemoattractants Stem Cell Factor (SCF) or Interleukine-3 (IL-3), the recruitment to the peritoneal cavity was approximately 50% less in SAMSN1- mice when compared to WT mice. Transwell migration assays in the presence of the chemoattractants showed that SAMSN1- BMMCs migrate 40% and 80% less than, respectively, in the presence of SCF or IL-3 when compared to WT mice. These results were confirmed in SAMSN1 knockdown RBL-2H3 MCs. Furthermore, SAMSN1- BMMCs showed a reduced velocity of migration and migrated a shorter distance in comparison to WT BMMCs. When stimulated via Fc?RI, the SAMSN1- BMMCs spread less than WT BMMCs. Furthermore, few filopodia and lamellipodia were observed in SAMSN1- BMMCs during migration. The expression of cortactin and vimentin was also lower in SAMSN1- BMMCs whenAbstract vi compared to WT BMMCs. However, the expression of vinculin and talin as well as RhoA, Rac1 and Cdc42 GTPases was similar between SAMSN1- BMMCs and WT BMMCs. The reduction in the spread area in SAMSN1- BMMCs was not sufficient to reduce or prevent ?-hexosaminidase release after stimulation via Fc?RI. These findings indicate that SAMSN1 plays a role in homing and recruitment of MCs, which occurs during infection or inflammation. Therefore, SAMSN1 may be a target for new therapeutic approaches to the treatment of these processes.
 
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Data de Publicação
2020-05-04
 
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