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Thèse de Doctorat
DOI
https://doi.org/10.11606/T.17.2021.tde-28012022-115732
Document
Auteur
Nom complet
Renato Elias Rodrigues de Souza Santos
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
Ribeirão Preto, 2021
Directeur
Jury
Silva Neto, José Freire da (Président)
Koide, Tie
Monesi, Nadia
Silva, Aline Maria da
Titre en portugais
Fatores de transcrição da família Fur e a resposta a ferro e zinco em Chromobacterium violaceum
Mots-clés en portugais
Chromobacterium violaceum
Família Fur
Fatores de transcrição
Homeostase de ferro e zinco
Imunidade nutricional
Transportador de zinco
Virulência bacteriana
Resumé en portugais
Os metais de transição ferro e zinco são micronutrientes essenciais a todas as formas de vida. Estes metais desempenham funções catalíticas, estruturais e regulatórias, atuando como cofator de inúmeras proteínas em bactérias e em eucariotos. No contexto da infecção, tanto o hospedeiro vertebrado quanto os patógenos competem por esses metais. As bactérias utilizam inúmeras estratégias para superar os mecanismos de imunidade nutricional do hospedeiro e ter acesso ao ferro e ao zinco. Nesse trabalho, caracterizamos os fatores de transcrição Fur e Zur quanto às suas funções na manutenção da homeostase de ferro e zinco e na virulência da bactéria ambiental Chromobacterium violaceum, um patógeno oportunista de humanos. A obtenção do mutante nulo Δfur foi possível somente em limitação de ferro, indicando que Fur é condicionalmente essencial em C. violaceum. O mutante espontâneo FurR40S, que tem Fur parcialmente funcional, mostrou maior produção de sideróforos e susceptibilidade ao estresse oxidativo. O mutante Δfur teve fenótipos pleiotrópicos, como aumento na produção de sideróforos, redução de crescimento e sobrevivência na presença de ferro e peróxido de hidrogênio e diminuição na produção de biofilme e na motilidade do tipo swimming. Muitos dos problemas gerais de fitness do mutante Δfur foram revertidos na linhagem Δfur T8 que possui inserção do transposon T8 em um locus CRISPR/Cas. Tanto a linhagem Δfur quanto a Δfur T8 apresentaram forte atenuação de virulência em camundongos, indicando a importância de Fur na patogênese de C. violaceum. Por fim, demonstramos que em suficiência de ferro, Fur atua como repressor dos genes cbaF e cbuA, relacionados com uso de ferro via sideróforos. Em relação ao fator de transcrição Zur, ensaios de β-galactosidase revelaram que esse regulador atua como repressor de um operon que codifica Zur, duas proteínas hipotéticas e o transportador de alta afinidade ZnuABC. O promotor deste operon possui um Zur-box e foi desreprimido em limitação de zinco. O único fenótipo encontrado para o mutante Δzur foi um aumento em moléculas indutoras de quorum sensing em sobrenadantes de suas culturas. No entanto, na ausência do transportador ZnuABC, C. violaceum ficou mais susceptível à carência de zinco induzida por tratamento com EDTA ou com a proteína ligadora de metais calprotectina. Demonstramos a importância de zinco e do transportador ZnuABC na produção de violaceína, na formação de biofilme, na competição bacteriana e na susceptibilidade a antibióticos. Ensaios de infecção in vitro revelaram que o mutante ΔznuCBA é mais susceptível a morte por neutrófilos, corroborando dados obtidos em colaboração, de que este mutante é atenuado para virulência em camundongos. Em conjunto, essas caracterizações demonstram a relevância dos reguladores Fur e Zur e do transportador ZnuABC na manutenção da homeostase de ferro e zinco e sua importância na virulência de C. violaceum.
Titre en anglais
The Fur family of transcription factors and the response to iron and zinc in Chromobacterium violaceum
Mots-clés en anglais
Bacterial virulence
Chromobacterium violaceum
Fur family
Homeostasis of iron and zinc
Nutritional immunity
Transcription factors
Zinc transporter
Resumé en anglais
The transition metals iron and zinc are micronutrients essential to all forms of life. These metals perform catalytic, structural, and regulatory functions, acting as a cofactor of numerous proteins in bacteria and eukaryotes. In the context of infection, both the vertebrate host and the pathogens compete for these metals. Bacteria use numerous strategies to overcome the mechanisms of host nutritional immunity and to gain access to iron and zinc. In this work, we characterized the transcription factors Fur and Zur regarding their roles in maintaining iron and zinc homeostasis and in the virulence of the environmental bacterium Chromobacterium violaceum, an opportunistic human pathogen. Obtaining null mutant Δfur was only possible under iron limitation, indicating that Fur is conditionally essential in C. violaceum. The spontaneous mutant FurR40S, which has Fur partially functional, showed increased production of siderophores and susceptibility to oxidative stress. The Δfur mutant had pleiotropic phenotypes, such as increased siderophore production, reduced growth and survival in the presence of iron and hydrogen peroxide, and decreased biofilm production and swimming motility. Many of the general fitness problems of the Δfur mutant were reversed in the Δfur T8 strain that has an insertion of the T8 transposon at a CRISPR/Cas locus. Both the Δfur and Δfur T8 strains showed strong attenuation of virulence in mice, indicating the importance of Fur in the pathogenesis of C. violaceum. Finally, we demonstrate that in iron sufficiency Fur acts as a repressor of cbaF and cbuA genes related to iron use via siderophores. Regarding the Zur transcription factor, β-galactosidase assays revealed that this regulator acts as a repressor of an operon that encodes Zur, two hypothetical proteins, and the highaffinity transporter ZnuABC. The promoter of this operon has a Zur-box and was derepressed in zinc limitation. The only phenotype found for the Δzur mutant was an increase in quorum sensing molecules in its culture supernatants. However, in the absence of the ZnuABC transporter, C. violaceum was more susceptible to zinc deficiency induced by treatment with EDTA or the metal-binding protein calprotectin. We demonstrate the importance of zinc and the ZnuABC transporter in violacein production, biofilm formation, bacterial competition, and antibiotic susceptibility. In vitro infection assays revealed that the ΔznuCBA mutant was more susceptible to killing by neutrophils, corroborating collaborative data that this mutant is attenuated for virulence in mice. Together, these characterizations demonstrate the relevance of the Fur and Zur regulators and the ZnuABC transporter in maintaining iron and zinc homeostasis and their importance in the virulence of C. violaceum.
 
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Date de Publication
2022-02-18
 
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