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Dissertação de Mestrado
DOI
https://doi.org/10.11606/D.17.2021.tde-28012022-115436
Documento
Autor
Nome completo
Santiago Andres Garcia Iturralde
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2021
Orientador
Banca examinadora
Espreafico, Enilza Maria (Presidente)
Assis, Leandro Henrique de Paula
Cardoso, Alexandre Bruni
Cunha, Larissa Dias da
Título em português
Participação da cadeia leve de dineína 2, DYNLL2, na dinâmica de montagem e desmontagem do cílio primário
Palavras-chave em português
Cílio primário
Dinâmica do cílio primário
DYNLL2
Resumo em português
O cílio primário é uma organela sensorial da superfície celular, presente na maioria das células quiescentes ou diferenciadas em vertebrados. Estruturalmente semelhante aos cílios móveis e flagelos, o cílio primário é formado por um axonema central recoberto por um domínio da membrana plasmática e apoiado a um corpúsculo basal, o centríolo mãe. Defeitos nas proteínas que formam o cílio ou em sua maquinaria de montagem causam doenças denominadas ciliopatias. A dinâmica da montagem e desmontagem e a função sensorial do cílio primário requer uma atividade contínua do transporte intraciliar bidirecional, que é semelhante ao transporte intraflagelar e envolve os motores moleculares dineína citoplasmática e cinesinas. As proteínas DYNLLs são cadeias leves multifuncionais que interagem com diversas proteínas, incluindo a Miosina-Va. Recentemente nosso grupo identificou interação da Miosina-Va com a proteína centrossomal-ciliar RPGRIP1L localizadas no corpúsculo basal dos cílios primários. Sabendo da interação da DYNLL2 com Miosina-Va e desta com o cílio primário, o presente estudo teve como objetivo esclarecer o papel da DYNLL2 na dinâmica de montagem e desmontagem do cílio primário. Os objetivos específicos deste trabalho foram analisar a localização da DYNLL2 na estrutura do cílio primário e avaliar os efeitos do silenciamento e superexpressão da DYNNL2 na dinâmica e fenótipo do cílio primário. Para responder nossas hipóteses foram usadas as células do epitélio pigmentado da retina humana imortalizadas com o vetor pGRN145 hTERT (RPE-1 hTERT). Para a superexpressão, foi utilizado o vetor lentiviral FUGW-DYNLL2, e para o silenciamento, utilizamos o vetor FUG.12-shDYNLL2. Após a transdução dos vetores, as células foram separadas por sorting celular de acordo com a intensidade de fluorescência, a fim de homogeneizar a população das células. A modulação da expressão da DYNLL2 foi confirmada através do qPCR-RT e imunodetecção de proteínas (Western blot). A localização celular da DYNLL2 foi analisada através da imunocitoquímica seguida de visualização e registro por microscopia confocal. A dinâmica da montagem e desmontagem foi estudada calculando a porcentagem de células ciliadas e o comprimento ciliar. Nossos dados demonstram a localização da DYNLL2 no centrossomo e na base do cílio primário. As análises fenotípicas mostram que nem a superexpressão nem o silenciamento da DYNLL2 afetam o número de células ciliadas, mas em várias condições de cultivo, tanto a superexpressão como o silenciamento reduzem o comprimento ciliar e aumentam a porcentagem de células na fase G0/G1 do ciclo celular. Os dados do presente estudo nos levam a concluir que a proteína DYNLL2 participa na dinâmica de montagem e/ou desmontagem dos cílios primários em células epiteliais e retarda o ciclo celular.
Título em inglês
Participation of dynein 2 light chain, DYNLL2, in the dynamics of assembly and disassembly of the primary cilia
Palavras-chave em inglês
Dynamics of primary cilia
DYNLL2
Primary cilia
Resumo em inglês
The primary cilium is a cell surface sensory organelle present in most quiescent or differentiated cells in vertebrates. Structurally similar to mobile cilia and flagella, the primary cilium is formed by a central axoneme covered by a domain of the plasma membrane and supported by a basal body, the mother centriole. Defects in the proteins that make up the cilium or in their assembly machinery cause diseases called ciliopathies. The dynamics of assembly and disassembly and sensory function of the primary cilium require a continuous activity of bidirectional intraciliary transport, which is similar to intraflagellar transport and involves the molecular motors of cytoplasmic dynein and kinesins. DYNLLs are multifunctional light chains that interact with several proteins, including Myosin-Va. Recently, our group identified an interaction of Myosin-Va with the centrosomal-ciliary protein RPGRIP1L located in the basal corpuscle of the primary cilia. Knowing the interaction of DYNLL2 with Myosin-Va and this with the primary cilia, the present study aimed to clarify the role of DYNLL2 in the dynamics of assembly and disassembly of the primary cilia. The specific objectives of this work were to analyze the location of DYNLL2 in the structure of the primary cilia and to evaluate the effects of silencing and overexpression of DYNNL2 on the dynamics and phenotype of the primary cilia. To answer our hypotheses, human retinal pigment epithelial cells immortalized with the vector pGRN145 hTERT (RPE-1 hTERT) were used. For overexpression, we used the lentiviral vector FUGW-DYNLL2, and for silencing, we used the vector FUG.12-shDYNLL2. After vector transduction, cells were sorted by cell sorting according to fluorescence intensity, in order to homogenize the cell population. Modulation of DYNLL2 expression was confirmed by qPCR-RT and protein immunodetection (Western blot). The cell location of DYNLL2 was analyzed through cellular immunocytochemistry followed by visualization and recording by confocal laser microscopy. The dynamics of assembly and disassembly was studied by calculating the percentage of hair cells and hair length. Our data demonstrate the centrosomal and ciliary localization of DYNLL2, and phenotypical analysis showed that either overexpression or silencing of DYNLL2 reduced the ciliary length, but did not affect the number of ciliated cells. Also, interfering with DYNLL2 expression increased the percentage of cells in the G0/G1 phase of the cell cycle. The data from the present study lead us to conclude that the DYNLL2 protein participates in the assembly and/or disassembly dynamics of primary cilia in epithelial cells and delays their cell cycle.
 
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Data de Publicação
2022-02-16
 
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