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Thèse de Doctorat
DOI
https://doi.org/10.11606/T.17.2020.tde-28012020-102706
Document
Auteur
Nom complet
Edismauro Garcia Freitas Filho
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
Ribeirão Preto, 2019
Directeur
Jury
Jamur, Maria Celia (Président)
Costa Neto, Claudio Miguel da
Leite, Maria de Fatima
Silva, Luis Lamberti Pinto da
Titre en anglais
Lipid raft associated molecules modulate signal transduction and inflammatory mediator release in mast cells
Mots-clés en anglais
Gangliosides derived from GD1b
Inflammatory mediators
Lipid rafts
Mast cells
Proteomic analysis
RACK
Regulated secretion
Signal transduction
Resumé en anglais
Mast cells (MCs) play an essential role in innate immunity, allergy, and inflammation. The action of MCs is directly related to their release of bioactive mediators. Following activation of the high affinity IgE receptor (Fc?RI), initial signal transduction events occur in lipid rafts (LRs) in the plasma membrane. In order to better understand the important role of LR in MC function, attention was first directed towards the role of the MC specific GD1b-derived gangliosides present in LRs in modulating mediator release. Cross-linking these gangliosides with mAbAA4 activated MCs without inducing degranulation. However, ganglioside cross-linking resulted in the release of newly formed lipid mediators (prostaglandins D2 and E2) and newly synthesized mediators (interleukin-4, interleukin-6 and TNF-?). These responses were respectively due to partial activation of the arachidonate cascade and induction of MAP Kinase phosphorylation and activation of transcription factors. It then was of interest to examine the protein composition of LRs from RBL-2H3 MCs by qualitative mass spectrometry. 949 different LR proteins were identified. Functional enrichment analysis demonstrated an intimate association of these proteins with cellular membrane compartments and an involvement with MC biological processes, especially those related to regulated secretion, organization of macromolecular complexes, and signal transduction. Moreover, in this LR proteome, RACK1 was identified for the first time in MCs. RACK1 is a multifaceted scaffold protein that is a critical hub for intracellular signaling and immunoregulatory responses. Therefore, it was important to characterize the functional role of RACK1 in MCs. RACK1 knockdown in RBL-2H3 MCs affected cell morphology and resulted in a drastic rearrangement of the actin cytoskeleton with increased basal and stimulus-induced degranulation. The cortical region of the RACK1 knockdown MCs had F-actin free cortical regions, which may facilitate fusion of CD63+- secretory granules with the plasma membrane, thus explaining the increased levels of degranulation. Furthermore, RACK1 positively influences the release of newly synthesized mediators. Additionally, RACK1 depletion showed a profound impact on Ca2+-mobilization. In conclusion, this study demonstrates that the LR associated molecules, MC-specific GD1bderived gangliosides and the scaffold protein RACK1, modulate signal transduction and subsequent mediator release in MCs, providing additional information to elucidate the MC functions.
Titre en portugais
Moléculas associadas aos lipid rafts modulam a transdução de sinal e a liberação de mediadores inflamatórios em mastócitos
Mots-clés en portugais
Análise proteômica
Gangliosídeos derivados do GD1b
Lipid rafts
Mastócitos
Mediadores inflamatórios
RACK1
Secreção regulada
Transdução de sinal
Resumé en portugais
Os mastócitos (MCs) desempenham um papel essencial na imunidade inata, alergia e inflamação. A função dos MCs é diretamente relacionada à liberação de seus mediadores bioativos. Após ativação do receptor de alta afinidade para IgE (Fc?RI), os eventos iniciais da transdução de sinal inicial acontecem nos lipid rafts (LRs) da membrana plasmática. Com a intenção de melhor entender a importância dos LRs na função dos MCs, a atenção foi inicialmente voltada para o papel dos gangliosídeos derivados do GD1b, específicos de MCs e presentes nos LRs, na modulação da liberação de mediadores. O intercruzamento desses gangliosídeos através do mAbAA4 ativa os MCs sem induzir a desgranulação. Entretanto, o intercruzamento dos gangliosídeos resultou na liberação de mediadores lipídicos neoformados (prostaglandinas D2 e E2) e neossintetizados (interleucina-4, interleucina-6 e TNF-?). Essas respostas foram resultantes, respectivamente, da ativação parcial da via do ácido araquidônico e indução da fosforilação das MAP kinases e ativação de fatores de transcrição. Posteriormente foi de interesse investigar as proteínas que compõe os LRs de MCs RBL-2H3 através da espectrometria de massa qualitativa. 949 diferentes proteínas foram identificadas nos LRs. A análise de enriquecimento funcional demonstrou uma íntima associação dessas proteínas com compartimentos celulares com membranas e um envolvimento com processos biológicos de MCs, especialmente aqueles relacionados à secreção regulada, organização de complexos macromoleculares e transdução de sinal. Ainda, nesse proteoma de LRs, a RACK1 foi identificada pela primeira vez em MCs. RACK1 é uma proteína adaptadora multifuncional e um eixo central crítico para a sinalização intracelular e respostas imunorregulatórias. Portanto, foi importante caracterizar o papel funcional da RACK1 em MCs. O knockdown de RACK1 em MCs RBL-2H3 afetou a morfologia celular e resultou em um drástico rearranjo do citoesqueleto de actina com aumento da desgranulação basal e induzida por estímulo. A região cortical dos MCs knockdown para RACK1 apresentaram áreas livres de F-actina, o que pode facilitar a fusão de grânulos secretórios CD63+ com a membrana plasmática, explicando desta forma os níveis aumentados de desgranulação. Ainda, a RACK1 influencia positivamente a liberação de mediadores neossintetizados. Adicionalmente, a depleção de RACK1 demonstrou um impacto expressivo na mobilização de Ca2+. Concluindo, esse estudo demonstra que moléculas associadas aos LRs, os gangliosídeos derivados do GD1b específicos de MCs e a proteína adaptadora RACK1, modulam a transdução de sinal e a subsequente liberação de mediadores em MCs, fornecendo informações adicionais para a compreensão das funções de MCs.
 
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Date de Publication
2020-04-29
 
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