As miosinas da classe V têm função essencial no tráfego de organelas e participam na via de transdução de sinal de cálcio, secreção, expressão de moléculas na superfície celular; transporte de mRNA e complexos proteicos e possivelmente na dinâmica do centrossomo e fuso mitótico. Com o objetivo de contribuir para uma melhor caracterização do papel de cada uma das três formas de miosina V (MV) identificadas, o presente trabalho desenvolveu a estratégia de selecionar um segmento de aproximadamente 50 aminoácidos da sequência dessas miosinas, com baixa conservação entre as mesmas, supondo que, quando expressos em células de mamíferos, poderiam interferir com funções específicas de cada um dos membros dessa classe. Os segmentos MVa1274-1328 e MVc1179-1232 foram amplificados por RT-PCR, sequenciados e clonados em vetores de expressão bacteriano (pGEX) e de mamífero (pEGFP e pDsRed). Estudos fenotípicos na linhagem de melanoma murino B16-F10 revelaram que a expressão de MVa1274-1328EGFP induz um decréscimo de 93% no número de células transfectadas no intervalo de 18 a 72 horas após a transfecção e a expressão de MVc1179-1232EGFP induz em torno de 37% de decréscimo, enquanto que o número de células controle, expressando a EGFP sozinha, aumenta em torno de 35% durante o mesmo intervalo de tempo. Células superexpressando MVa1274-1328-EGFP exibem tamanho menor que o usual, forma redonda e são facilmente liberadas do substrato. Análise do DNA e F-actina em células transfectadas com MVa1274-1328-EGFP, 20 horas após transfecção, mostrou que em torno de 70% das células transfectadas exibem cromatina condensada ou fragmentada, bem como, a disposição da F-actina em forma de anel cortical e a presença de bolhas na superfície celular, características de resposta apoptótica. Foi demonstrado que MV, através da interação com a cadeia leve de dineína (DLC2), sequestra o fator pró-apoptótico, Bmf, no citoesqueleto de actina, sendo que, danos à célula, como bloqueio de adesão, induzem a liberação deste fator que age sobre a Bcl2 desencadeando a apoptose. Demonstramos aqui, que a proteína expressa em bactéria, MVa1274-l328GST, mas não a MVc1179-1232GST, foi capaz de interagir com a DLC2 in vitro, sugerindo que o efeito da MVa1274-1328EGFP sobre a viabilidade celular em células de melanoma seja devido à competição por DLC2/Bmf liberando esse fator dos seus sítios de ancoragem. Quanto à MVc1179-1232egfp, não temos qualquer evidência dos mecanismos subjacentes que expliquem seu efeito, seja sobre a morte ou proliferação celular. Nesse trabalho, verificamos também que a MVa apresenta expressão e localização diferencial em três linhagens de melanoma humano dos estágios radial, vertical e metastático da progressão tumoral. Os dados apresentados reforçam as evidências do envolvimento da MVa em apoptose, a qual funciona como barreira para a transformação maligna. Além disso, esse trabalho identifica uma nova ferramenta que afeta a viabilidade celular, podendo servir como sonda para investigar a função das MV na resposta apoptótica em diversos tipos celulares e ainda como um potencial reagente para interferência no crescimento tumoral.

Class V myosins are actin-based molecular motors involved in severa! celular processes such as organelle trafficking, secretion, calcium-dependent signaling, expression of cell surface molecules; transport of mRNA and protein complexes, and probably centrosome and mitotic spindle dynamics. In order to better understand the function ofthe three known members of class V myosins (MV), we selected an approximately 50 amino acid segment displaying low degree of conservation among them, reasoning that when expressed in mammalian cells, they would interfere with each member's specific functions. MVa1274-1328 and MVc1179-1232 segments were successfully amplified by RT-PCR and cloned either into bacterial (pGEX) or mammalian (pEGFP and pDsRed) expression vectors. Phenotypic studies on B16-F10 murine melanoma cells revealed that MVa1274-1328-EGFP expressjon induces about 37% of cell loss. In contrast, the number ofcontrol cells expressing EGFP alone increases nearly 35% during the same time course. Cells overexpressing MVal274-1328EGFP exhibited unusually small size, round shape, and the majority of them detached from the substrate during the time course of the experiment. Analysis of DNA and F-actin in cells transfected with MVa1274-1328EGFP, 20 hours after transfection, showed that about 70% ofthe transfected cells exhibited condensed or fragmented chromatin, as well as the presence of a cortical ring of filamentous actin and membrane blebbing. It has been shown that MV plays a role in the sequestering ofthe pro-apoptotic protein, Bmf, to the actin cytoskeleton through dynein light chain-2 (DLC2) and damage signals, such as loss of cell attachment, lead to the release of Bmf and its subsequent binding to the pro-survival Bcl2 protein, triggering apoptosis. We demonstrated here that bacterially expressed MVa, but not MVc1179-1232GST, was capable ofinteracting with DLC2, in vitro, suggesting that the loss of cell viability caused by expression of MVa1274-1328EGFP is due to its role in competing for DLC2/Bmf, releasing this pro-apoptotic factor from its anchorage sites. Regarding MVc1179-1232EGFP, we have no evidence for underlying mechanisms of its effect in cell death or proliferation. Also, we demonstrated that MVa is differentially expressed and its subcellular localization varies among melanoma cell lines from radial, vertical or metastatic growth phases. Our data reinforce the involvement of MV in the apoptotic response and in tumor progression, since evading apoptosis is an important step in the development of malignancy. Additionally, this work provides a new molecular tool for the induction of apoptosis in melanoma cells, that can be used both to clarify MVa function in the apoptotic response and as a potential reagent to arrest tumor growth.