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Master's Dissertation
DOI
https://doi.org/10.11606/D.17.2020.tde-19082020-091727
Document
Author
Full name
Maria Juliana Rolon Rojas
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Ribeirão Preto, 2019
Supervisor
Committee
Rocha, Rafael Silva (President)
Pupo, Monica Tallarico
Coelho, Paulo Sergio Rodrigues
Title in English
Development of synthetic biology tools by methods in silico and in vivo applied to bacteria of biotechnology importance
Keywords in English
Bioinformatics
Biosensors
Synthetic biology
Abstract in English
In spite of the enormous scientific and biotechnological advances achieved by Synthetic Biology in the last decades, one of the great limitations in its development consists of the low diversity of standard biological parts (qualitatively and quantitatively characterized) that allow the construction of complex synthetic circuits. In this context, the increasing number of sequenced bacterial genomes, the bioinformatic tools and the advancement of molecular techniques allow the exploitation of these systems. Such an approach allows the exploration of the diverse genetic elements to create orthogonal synthetic tools bio-inspired in microorganisms that have evolved for containing in their genomes genetic elements that could be useful for biotechnological purposes. One of the most remarkable microorganisms that fit with this description is Pseudomonas putida, due to its great plasticity and tightly transcriptional control which allow it to degrade more than 100 aromatic compounds derived from lignin. Thus, in the present work, new tools for the analysis of transcriptional factors (TFs) with their cis-regulatory elements were designed, which resulted in four new vectors with validation capacity in a large number of different bacteria species based on pSEVA plasmids family architecture; with reporter systems containing the proteins sGFP (super folding green fluorescent protein), mCherry and degradation tags adjustable with the growth temperature of each microorganism. Also, we studied an in silico approach modelling proteins by threading in TF from the genome of Pseudomonas putida and then, we perform a molecular docking using the major aromatic compounds that have been reported in the literature as degraded by this bacteria. This result in the selection of candidates proteins from the MarR family PP_3359, VanR which response to molecules of the degradation pathway to Ferulic acid; And the protein GalR, LysR type regulator which responds Galic Acid and homologues in order to create tools for synthetic biology-inspired by natural systems for biotechnological applications.
Title in Portuguese
Desenvolvimento de ferramentas de biologia sintética por métodos in silico e in vivo aplicados a bactérias de importância biotecnológica
Keywords in Portuguese
Bioinformática
Biologia sintética
Biossensores
Abstract in Portuguese
Apesar dos enormes avanços científicos e biotecnológicos alcançados pela Biologia Sintética nas últimas décadas, uma das grandes limitações em seu desenvolvimento consiste na baixa diversidade de partes biológicas padrão (caracterizadas qualitativa e quantitativamente) que permitem a construção de circuitos sintéticos complexos. Nesse contexto, o crescente número de genomas bacterianos sequenciados, as ferramentas bioinformáticas e o avanço das técnicas moleculares permitem a exploração desses sistemas. Essa abordagem permite a exploração dos diversos elementos genéticos para criar ferramentas sintéticas ortogonais bio-inspiradas em microorganismos que evoluíram para conter em seus genomas elementos genéticos que poderiam ser úteis para fins biotecnológicos. Um dos microorganismos mais notáveis que se encaixam nessa descrição é Pseudomonas putida KT2440, devido à sua grande plasticidade e controle transcricional, o que permite degradar mais de 100 compostos aromáticos derivados da lignina. Assim, no presente trabalho, foram projetadas novas ferramentas para a análise de fatores transcricionais com seus elementos reguladores cis, o que resultou em quatro novos vetores com capacidade de validação em um grande número de espécies de bactérias diferentes, com base na arquitetura da família dos plasmídeos pSEVA; com sistemas repórter contendo as proteínas sfGFP (super folding Green Fluorescence protein), mCherry e etiquetas de degradação ajustáveis à temperatura de crescimento de cada microorganismo. Além disso, estudamos uma abordagem de modelagem de proteínas in silico, modelando fatores transcricionais do genoma de Pseudomonas putida e, em seguida, realizamos um acoplamento molecular e virtual screening usando os principais compostos aromáticos que foram relatados na literatura como degradados por esta bactéria e um banco de dados com drogas aprovadas pela FDA. Isso resulta na seleção de proteínas candidatas da família MarR PP_3359 e VanR, que respondem a moléculas da via de degradação do ácido ferúlico; E o regulador de proteínas GalR da familia LysR, que responde ao ácido gálico, aos homólogos e algums medicamentos, a fim de criar ferramentas para a biologia sintética inspiradas em sistemas naturais para aplicações biotecnológicas.
 
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Publishing Date
2020-10-23
 
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